1.Биосенсорные системы: определения и терминология.

Определения

Биосенсор (биосенсорное устройство) – это аналитическое устройство, используемое для детекции веществ или компонентов, представляющих тот или иной интерес (аналитов – analytes), которое сочетает в себе биологический компонент и физико-химический детектор.

По определению профессора Энтони Тёрнера, главного редактора журнала, биосенсор является аналитическим устройством, содержащим биологический материал (ткани, клетки микроорганизмов, органеллы, клеточные рецепторы, ферменты, иммуноактивные компоненты, нуклеиновые кислоты и т.д.), находящийся в непосредственном контакте с физико-химическим преобразователем или преобразующей микросистемой. Последние могут быть представлены оптическим, электрохимическим, термометрическим, пьезоэлектрическим или магнитометрическим устройствами.

2. Биологический элемент: Это активный компонент биосенсора, который отвечает за специфичность и селективность. Он может быть:

• Ферментом: Катализирует химические реакции.

• Антителом: Обеспечивает специфическое связывание с антигенами.

• ДНК-зондом: Используется для выявления специфических последовательностей нуклеотидов.

3. Детектор: Часть биосенсора, которая преобразует биологическое взаимодействие в электрический или другой сигнал. Это может быть:

• Электрохимический детектор: Измеряет изменения тока или напряжения.

• Оптический детектор: Использует изменения в светопоглощении или флуоресценции.

• Механический детектор: Измеряет изменения в массе или механических свойствах.

4. Сигнал: Это выходной параметр, который измеряется детектором и отражает количество или концентрацию целевого вещества. Сигнал может быть количественным (например, концентрация) или качественным (например, наличие или отсутствие вещества).

Терминология

Специфичность: Способность биосенсора различать целевое вещество от других веществ в образце.

• Чувствительность: Минимальная концентрация целевого вещества, которую может обнаружить биосенсор.

• Время отклика: Время, необходимое для достижения стабильного сигнала после добавления целевого вещества.

• Стабильность: Способность биосенсора сохранять свои характеристики и производительность в течение определенного времени.

Применение

Биосенсоры находят широкое применение в различных областях:

• Медицина: Для диагностики заболеваний (например, глюкозные сенсоры для мониторинга уровня сахара в крови).

• Экология: Для мониторинга загрязнителей в окружающей среде.

• Пищевая безопасность: Для обнаружения патогенов или токсинов в продуктах питания.

• Биотехнология: Для контроля процессов ферментации и других производственных процессов.

2) Основные преимущества использования биосенсоров по сравнению с традиционными физико-химическими методами анализа.

Преимущества использования биосенсоров по сравнению с традиционными физико-химическими методами анализа включают:

безреагентность – для выполнения анализа как правило не требуется производить добавление к исследуемому образцу каких-либо химических соединений, реагентов;

простота анализа – отсутствует необходимость привлечения к его выполнению высококвалифицированного персонала;

низкая стоимость одиночного анализа, обусловленная малым количеством используемого биологического материала, простотой аппаратурной реализации;

высокая чувствительность,

специфичность – обусловлена применением биологического материала, осуществляющего высокоселективные превращения некоторых веществ (их окисление, трансформацию); изменяющего свои свойства в присутствии биологически активных соединений; образующего с анализируемым соединением легко идентифицируемые комплексы;

многократность – возможность длительного измерения образцов без замены рецепторного элемента,

возможность использования в полевых или домашних условиях.

3. Биологические элементы биосенсорных систем

Биосенсорные системы представляют собой устройства, которые используются для обнаружения и анализа биологических и химических соединений. Они находят применение в медицине, экологии, пищевой промышленности и других областях. Основой любой биосенсорной системы являются биологические элементы, которые определяют специфичность и чувствительность устройства.

Основные типы биологических элементов

Биологические элементы, или биорецепторы, являются ключевым компонентом биосенсоров. Они взаимодействуют с анализируемым веществом (анализантом) и обеспечивают преобразование биохимического сигнала в измеряемую форму. К основным типам биологических элементов относятся:

Ферменты. Эти белковые молекулы катализируют специфические химические реакции. Ферменты широко используются в биосенсорах благодаря их высокой специфичности к субстрату. Примером являются глюкозооксидазные биосенсоры, применяемые для измерения уровня глюкозы в крови.

Антитела. Иммунологические биосенсоры используют антитела для связывания специфических антигенов. Этот метод подходит для диагностики заболеваний и выявления патогенов.

Нуклеиновые кислоты. ДНК- и РНК-биосенсоры применяются для детекции генетического материала, что важно для диагностики инфекций и генетических исследований.

Клетки и ткани. Полноценные клетки или их компоненты используются для обнаружения токсичных веществ, анализа метаболических процессов и скрининга лекарств.

Рецепторные белки. Эти молекулы участвуют в специфическом связывании анализанта, например, гормонов, нейромедиаторов или лекарственных средств.

Принципы работы биологических элементов

Биологические элементы работают на основе молекулярного распознавания. Этот процесс включает специфическое взаимодействие между анализантом и биорецептором. В результате взаимодействия возникает биохимический сигнал, который затем преобразуется физико-химическим преобразователем в измеряемый электрический, оптический или тепловой сигнал.

Способность биологических элементов селективно распознавать анализанты обусловлена их молекулярной структурой. Например, ферменты обладают активным центром, который соответствует форме и химическим свойствам субстрата, а антитела связываются с антигенами через эпитопы.

4. Основные требования, предъявляемые к биологическим система при построении биосенсора (тут написано про тест-объекты, можно перефразировать про сами биосистемы, я хз, я тупой и не понимаю)

Тест-объект биосенсорного устройства должен удовлетворять ряду

требований, главными из которых являются:

1) доступность;

2) относительно невысокая стоимость;

3) безопасность в эксплуатации (следует упомянуть, что в качестве тест-объекта могут быть использованы бактерии и нуклеиновые кислоты, кроме того, биосенсор может применяться, например, для анализа компонентов воды в сети водоснабжения или работающего биореактора; в этих условиях указанное требование приобретает особую актуальность);

4) тест-объект должен быть селективен по отношению к определяемому веществу (или группе веществ);

5) должен обеспечивать воспроизводимость результатов анализа;

6) должен быть работоспособным в заданном диапазоне параметров среды (температура, давление, влажность, рН, ионная сила и т. п.). Указанный список требований отнюдь не полный, и в каждом конкретном случае могут быть оговорены и другие требования.

Названным требованиям в той или иной мере отвечают все те упомянутые ранее биологические компоненты (ферменты, антитела, рецепторы и др.), применяемые в биосенсорных устройствах. Следует, однако, отметить, что идеальный вариант, т. е. биологический тестирующий элемент, полностью удовлетворяющий хотя бы указанным требованиям, подобрать практически невозможно. Поэтому реально выбирается оптимальный вариант. Вероятно, последнее частично и объясняет наличие значительного разнообразия тест-объектов даже в однотипных конструкциях биосенсорных устройств, предназначенных

5. Ферменты как элемент биосенсорной системы (про глюкометр (глюкозооксидаза не забудьте)

В наиболее распространенных в настоящее время моделях биосенсоров успешно используются ферменты; в результате биохимических реакций возникают такие продукты, как ионы (в частности, протоны, ионы аммония и т.д.), электроны, происходит выделение тепла или света, изменяется цвет реакционной смеси, что может быть зарегистрировано различными видами преобразователей. Важным классом ферментов, применяемых в биосенсорах, являются оксидоредуктазы, катализирующие окисление субстратов, и гидролазы, катализирующие гидролиз соединений.

Фермент обычно используют в иммобилизованном виде. Благодаря этому снижается его количество, необходимое для рутинных анализов, и устраняется необходимость повторных определений ак­тивности ферментного препарата, что необходимо для получения воспроиз­водимых результатов. Кроме того, при использовании определенных методов иммобилизации зачастую повышается стабильность фермента.

В функционировании ферментного электрода можно выделить 5 стадий:

1) перенос субстрата к поверхности электрода;

2) диффузия субстрата через мембрану к активному центру фермента;

3) реакция в активном центре;

4) перенос продукта ферментативной реакции через мембрану к по­верхности электрода;

5) измерение концентрации продукта у поверхности электрода.

При разработке ферментных электродов важно идентифицировать лимитирующую стадию, от которой зависит эффективность работы анализатора. Такой стадией может быть перенос субстрата через мембрану, реакция его с ферментом, перенос продукта реакции обратно через мембрану или регенерация фермента.

Технологические варианты сенсоров с иммобилизованными ферментами весьма разнообразны – колонки, трубки, полые во­локна и пр. С их помощью на практике определяют концентрацию широкого спектра соединений – глюкозы, аминокислот, моче­вины, пенициллина, АТФ, НАДН, ФМН, стероидов, триглице-ридов, желчных кислот и многих других.

6. Антитела как элемент биосенсорной системы. Реакция взаимодействия антигена с антителом.

Антитела – это сложные белковые молекулы, построенные из нескольких субъединиц, вырабатывающиеся в организмах позвоночных в ответ на проникновение чужеродных агентов (антигенов), например, токсинов, вирусов или чуждых организму макромолекул. Циркулирующие в крови антитела связываются с антигенами, деактивируют их и выводятся из организма. Кроме того, связанные антитела служат метками для микроорганизмов, подлежащих уничтожению. Антитела к малым молекулам (молекулярный вес < 10 000 Дальтон), являющимся чужеродными для организма можно получить, если чужеродные соединения ковалентно иммобилизовать на белке и данный комплекс (конъгат) ввести в организм экспериментального животного. В качестве белка-носителя достаточно часто используется бычий сывороточный альбумин. Низкомолекулярный компонент такого конъюгата носит название гаптен

Образование комплекса Аг с Ат на поверхности преобразователя биосенсора может быть измерено непосредственно или косвенно. Непосредственно можно зарегистрировать изменение массы с помощью пьезоакустического преобразователя, а также по изменению интенсивности полного внутреннего отражения в сенсоре оптического типа, применяя, например, метод регистрации. Связывание также может быть зарегистрировано простой оптической техникой, основанной на возбуждении и регистрации флуоресценции, если Аг или Ат конъюгировано с флуоресцентной меткой. В биосенсорах электрохимического типа для проявления комплекса антиген/антитело применяет ферментную метку.

Взаимодействие антиген – антитело считается наиболее селективным для применения в биосенсорах. С точки зрения физики, это взаимодействие осуществляется теми же по природе силами, что и взаимодействие фермента с субстратом: вандерваальсовыми силами, ионными, гидрофобными и гидрофильными взаимодействиями, водородными связями. Сложность применения антител в биосенсорах состоит в том, что акт связывания антигена часто тяжело зарегистрировать. Это является общим недостатком аффинных биосенсоров и требует применения специальных методов, например, использования меток. Другая сложность состоит в том, что аффинные взаимодействия часто имеют высокие значения константы ассоциации, т.е. слабо обратимы, и использующие их распознающие элементы часто являются одноразовыми или требуют специальных методов регенерации

7. Характеристика изолированных органелл, клеток и тканей как потенциальных биологических элементов биосенсорных систем.

Органелльные и клеточные биосенсоры

В биорецепторных элементах сенсоров достаточно часто используются надмолекулярные структуры (или органеллы – т.е. структуры, входящие в состав клеток, например, митохондрии, хлоропласты), а в ряде случаев и целые клетки: бактерии, микроскопические грибы, срезы тканей растительного или животного происхождения. Основой для их использования в сенсорах являются содержащиеся в них наборы ферментов. Назначением таких сенсоров может быть детекция соединений, представляющих интерес с медицинской и биотехнологической точек зрения, а также сенсоров для экологического контроля. Преимущество данного типа биосенсоров в сравнении с ферментными состоит в том, что ферменты в составе клеток и органелл находятся в естественном окружении, которое обеспечивает наилучшие условия для их продолжительного функционирования и высокой активности. Основным недостатком биосенсоров этого типа является их низкая селективность, а в ряде случаев и низкая скорость анализа, поскольку вещество должно не только оказаться в контакте с биорецептором, но и проникнуть внутрь клетки или органеллы, преодолевая барьер в виде клеточной стенки, клеточной мембраны, а продукт биохимической реакции выделиться во внеклеточное пространство.

Использование тканей растений и животных перспективно, но применяют­ся сравнительно редко. Во многих случаях они более стабильны, чем ферменты и клетки, а порой более специфичны, чем микробные клетки. Так, глутаматный биосенсор на осно­ве ткани свиной почки не откликается на мочевину, аланин, арги­нин, гистидин и другие аминокислоты.

Пример биосенсора: использование среза почек свиньи для определения глутамина.

8. Возможности применения отдельных организмов в качестве элемента биосенсора.

Новым словом в разработке биосенсоров является создание датчи- ков путем использования целых клеток микроорганизмов. При этом отмечаются следующие их достоинства:

1. Нет необходимости получать очищенные ферменты или другие компоненты клеток, можно непосредственно использовать целые клетки или срезы тканей без выделения и очистки белков. Это в конечном итоге приводит к значительному снижению стоимости.

2. Ферменты и другие биомолекулы находятся в их естественном окружении.

3. Активность ферментов стабилизирована.

4. Биосенсор можно регенерировать погружением в питательную среду. Микроорганизмы сохраняют жизнеспособность довольно долго.

5. Целые клетки могут содержать несколько кофакторов и фермен- тов, катализирующих реакции, которые трудно, если вообще воз- можно, осуществить с помощью одного иммобилизованного фер- мента.

Однако у таких биосенсоров есть и недостатки, среди которых обычно отмечают

1. Низкую селективность, обусловленную присутствием в клетке микроорганизма ряда ферментов, которые могут катализировать побочные реакции.

2. Часто наблюдаемый медленный отклик биосенсора, поскольку в диффузионные барьеры в данном случае включается и плазмати- ческая мембрана.

В качестве примеров можно привести использование клеток Neu rospora europea для определения аммиака, Тrichosроron brassicae для определения уксусной кислоты, Sarcina flava (глутаминаза) для опре- деления глутамина,. Этот список может быть многократно увеличен, поскольку мно- гие организмы (как одноклеточные, так и многоклеточные) являются источником тех или иных биополимеров, пригодных к использованию в качестве биологических тестирующих элементов биосенсоров. Сле- дует отметить, что замена биомолекул клетками зачастую не приводит к существенному изменению конструкции биосенсора. Во всяком случае, электрод для определения содержания глюкозы на основе им- мобилизованных клеток Pseudomonas fluorescens отличается от электрода Лайона и Кларка лишь тем, что на поверхность электрода Кларка нанесены иммобилизован- ные бактерии, а не фермент в очищенном виде. Да и по эксплуатаци- онным параметрам упомянутые электроды различаются мало.