РИ (реакции иммунитета) = АГ + АТ

Серологические реакции - это реакции между АГ и АТ, протекающее in vitro.

Характеризуются специфичностью (способность СР выявлять только гомологичные АТ и АГ) и чувствительностью (наименьшее количество АТ или АГ, которое может выявить СР).

Антитело - крупные глобулярные белки, которые синтезируются плазматическими клетками, направленные на нейтрализацию чужеродного агента.

Антиген - чужеродный агент.

Антитела состоят из лёгких и тяжёлых цепей. Вариабельная область отвечает за взаимодействие антитела с антигеном по типу "ключ-замок". Константные области взаимодействуют с другими клетками иммунной системы, привлекая их.

Ig M - имеют множество участков для связывания антигена. Вырабатываются первыми.

Титр АТ - предельное разведение сыворотки крови, при котором могут быть обнаружены антитела.

Титр - это наибольшее разведение сыворотки или материала с АГ, при котором ещё протекает четкая СР.

Для определения неизвестный АГ используют препараты, содержащие известные АТ, - диагностические сыворотки. Для определения неизвестных АТ используют препараты, содержащие известные АГ, - диагностикумы.

Классификация иммунологических реакций:

1. Что мы хотим найти:

• АТ --> серодиагностика. Значит, нам известен антиген.

• АГ --> имунноиндикация (определение наличия неизвестного антигена), иммуноидентификация (определение наличие конкретного антигена). Значит, нам известно антитело.

Выбор между серодиагностикой и иммунодиагностикой зависит от времени, которое прошло от начала заболевания, материала и клиники (специфика того или иного возбудителя).

2. Какое количество компонентов:

• Простые (только АГ + АТ, этого достаточно, чтобы увидеть результат).

• Сложные ( АГ + АТ + дополнительный компонент: флуорохром, фермент и т.д.)

3. Какой характер взаимодействия:

- агглютинации

- преципитация

- токсиконейтрализации

- с участием комплемента

- с использованием меченых антител или антигенов (применяют флюоресцентные, ферментные, радиоактивные метки).

🧫РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ - это склеивание корпускулярных антигенов (агглютиногенов) - микробов (бактерий), других клеток (эритроцитов) или частиц, носителей антигена, и специфических антител с образованием видимых глазом аггломератов - хлопьев. Реакция происходит только в присутствии электролита (физиологического раствора - 0,85% раствор NaCl).

Цели:

• иммуноидентификация возбудителя (антигена), выделенного из материала больного;

• определение антител в сыворотке (например, реакция Видаля при брюшной, реакция Райта при бруцеллёза).

О-агглютинация (O-антиген, входит в состав ЛПС) и Н-агглютинация (жгутики бактерий). Н-агглютинация протекает быстро и даёт осадок в виде рыхлых крупных хлопьев.

1. Реакция агглютинации (РА) на предметном стекле. Может быть ориентировочной, если используется просто диагностическая агглютинирующаая сыворотка, и окончательной, если используют адсорбированную (антитела сыворотки очищаются при помощи адсорбции, остаются только видоспецифичные антитела) агглютинирующую сыворотку.

Диагностические сыворотки получают от животных (кроликов, коз), гипериммунизированных соответствующим видом МО.

Для реакции необходимы:

• диагностические антитела в сыворотке;

• чистая культура возбудителя, выданная от больного;

• контроль: физ. раствор.

Положительная реакция - хлопьевидный осадок.

2. Развёрнутая реакция агглютинации в пробирках --> определение антител.

Для реакции необходимы:

• сыворотка больного;

• антигенный препарат - диагностикум (взвесь убитых микробов);

• физ. раствор

Готовят двукратное разведение сыворотки больного (от 1:50 до 1:800).

В пробирки с увеличивающимся разведения сыворотки больного добавляют равное количество диагностикума. Отмечают титр сыворотки, при котором произошла агглютинация.

Первые 5 пробирок - опытные. Контроли: 6-ая пробирка (контроль антигена - 1 мл физиологического раствора + 3 капли диагностикума) и 7-ая пробирка (содержит сыворотку в исходном разделении 1:25).

Положительная реакция - хлопьевидный осадок.

РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) АГГЛЮТИНАЦИИ:

1. Реакция непрямой гемагглютинации. Происходит склеивание эритроцитарного диагностикума соответствующими антителами (определение АГ или АТ).

Для реакции необходимы:

• эритроцитарный диагностикум, содержащий:

- взвесь эритроцитов;

- известные антигены или известные антитела (в случае известных антител реакция называется обратной непрямой гемагглютинацией), адсорбированные на эритроцитах.

• сыворотка больного, если известны антигены, или исследуемый материал, если известны антитела.

• физ. раствор

Производят двухкратное разведение сыворотки, каплю каждой вносят в лунки 96-луночных полистероловых планшетов, также в каждую лунку вносят эритроцитарный диагностикум (сенсибилизированные эритроциты). Контроли: эритроцитарный диагностикум с физиологическим раствором (контроль 1); несенсибилизированные эритроциты с физиологическим раствором (контроль 2); несенсибилизированные эритроциты с исследуемой сывороткой (контроль 3). Планшет помещают в термостат на 2 часа при 37°С.

Положительный результат - осадок эритроцитов в лунке имеет форму "зонтика". Отрицательный результат - эритроциты оседают в центре в форме "пуговки".

За титр принимают максимальное разведение сыворотки, дающее положительную реакцию в виде зонтика.

2. Латекс-агглютинация. В качестве диагностикума используют полимерные микрошарики из латекса, на поверхности которых адсорбированы известные антитела. Часто латекс-диагностикумы окрашены в яркий цвет. При образовании комплекса АГ+АТ происходит склеивание латексных частиц.

Для реакции необходимы:

• исследуемый материал (антигены);

• латексный диагностикум - частицы латекса с адсорбированными на них известными АТ (или наоборот);

• физ. раствор

Правила постановки аналогичны предыдущим.

3. Коагглютинация --> выявление антигенов. Близка по механизму к реакции обратной непрямой гемагглютинации и латекс-агглютинации. Диагностикумом является взвесь клеток Staphylococcus aureus штамма Cowan1. Способность штамма к адсорбции антител связана с высоким содержанием в клеточной стенке белка А, который имеет свойство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов. При соответствии определяемого антигена вирусной или бактериальной природы и антительного стафилококкового диагностикума происходит агглютинация.

🧪ПРЕЦИПИТАЦИЯ - осаждение растворимого антигена (преципитиногена) при действии антител в присутствии электролита (0,85% раствора NaCl).

Феномен преципитации - появление полос преципитации.

Обнаружение неизвестного антигена производят при ряде инфекционных заболеваний: сибирской язве, туляремии, менингите, оспе. То есть в основном используется для определения экзотоксинов.

Существует 2 методики постановки реакции преципитации:

- В жидкой среде

- В полужидком геле

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ:

1. Реакция кольцепреципитации.

• Преципитационные пробирки с малым диаметром.

Методика:

- вносят преципитирующую сыворотку (известные АТ);

- наслаивают по стенке длинным носиком пастеровской пипетки такое же количество антигена;

- придают пробирке вертикальное положение;

- оценка результата.

Положительная реакция - появление кольца молочного цвета на границе компонентов.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ:

• в чашку Петри помещают слой агарового геля;

• после застывания вырезают в нём лунки;

• помещают в лунки антитела/ антигены.

1. Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини. Один из компонентов (антиген/ антитело) помещают в лунку. Другой - смешивают с агаром. Например, немного остуженный 3% агар смешивают с специфической иммунной сывороткой в соотношении 1:1. В лунки вносят исследуемый антиген. Пластины инкубируют в камере в течение 24-48 часов при комнатной температуре.

В случае положительного результата молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют зону преципитации в виде мутного кольца. При постоянной концентрации антител в геле наблюдается прямая пропорциональность между концентрацией антигена и площадью зоны преципитации, а именно прямая зависимость между логарифмом диаметра преципитата и логарифмом исходного количества антигена в лунке, по которой и определяют концентрацию антигена.

2. Метод двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Принцип метода состоит в том, что и антигены, и антитела диффундируют навстречу друг к другу из двух пространственно разделенных лунок, вырезанных в геле. При эквивалентном соотношении между антигеном и антителами сыворотки образуется преципитат в виде белой линии, которая располагается между лунками. Метод Оухтерлони применяют для определения числа антигенов в исследуемом материале, оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными.

3. Метод иммуноэлектрофореза ИЭФ. Смесь антигенов лунке разделяется посредством электрофоретического разделения. В боковые канавки, идущие параллельно линии миграции белков, вносят препитирующую сыворотку и проводят иммунодиффузии в течение 12-24 часов. Антитела и разделённые электрофорезом антигены диффундируют в геле навстречу друг другу и образуют дуги преципитации. По их форме, числе и положению можно получить представление о составе исследуемой смеси антигенов.

✅РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ

Реакциями нейтрализации называются серологические реакции, в которых при взаимодействии биологически активного антигена со специфическими антителами нейтрализуется (снижается) его биологическая активность.

На практике применяют 2 типа реакций нейтрализации:

- реакция нейтрализации токсина АНТИТОКСИНОМ;

- реакция нейтрализации вирусов противовирусной сывороткой (рассматривается в курсе вирусологии).

Токсин = экзотоксин = антиген.

В качестве антигена в реакции нейтрализации может участвовать также и анатоксин. Его получают из экзотоксина. Анатоксин сохраняет антигенную структуру, но при обработке теряет свои токсические свойства.

Антитоксин = антитело.

Компоненты реакции:

• экзотоксин бактерий (неизвестный АГ);

• антитоксическая сыворотка (АТ).

Антитоксическим сыворотки получают путем иммунизации животных анатоксином.

Виды:

- in vivo;

- in vitro.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ТОКСИНА АНТИТОКСИНОМ in vivo:

1. Реакция нейтрализации на лабораторных животных. Исследуемый материал, в котором предполагают присутствие экзотоксина, смешивают со специфической антитоксической сывороткой. Смесь выдерживают в термостате, а затем вводят лабораторным животным. Если произошла реакция, то животные остаются живыми. Контрольным животным вводят тот же исследуемый материал без антитоксической сыворотки, они должны погибнуть.

2. Реакция нейтрализации в организме человека. Кожные пробы Шика и Дика, выявляющие наличие антитоксической иммунитета у детей к дифтерии (проба Шика) и скарлатине (проба Дика). Если в организме имеются антитела, то при введении малых доз токсинов воспалительной реакции наблюдаться не будет.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ТОКСИНА АНТИТОКСИНОМ in vitro:

1. Реакция флоккуляции - частный случай реакции ПРЕЦИПИТАЦИИ. Она происходит с образованием хлопьевидный массы при добавлении в пробирку с токсином (анатоксином) антитоксической сыворотки в присутствии электролита. Данную реакцию обычно используют для определения активности сыворотки (количества МЕ - международных единиц - в 1 мл сыворотки), что соответствует титру сыворотки. МЕ - количество антител сыворотки в 1 её мл.

Наиболее интенсивная и ранняя («инициальная») флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных количествах.

Lf (Limes flocculationis) - пороговая величина флокуляции. Lf – это то количество токсина (анатоксина), которое даёт интенсивную, «инициальную» флокуляцию с 1МЕ сыворотки.

Например, инициальная флоккуляции наступила в пробирке, где находятся 0,4 мл сыворотки и 40 Lf токсина или анатоксина. Следовательно, 0,4 мл данной сыворотки содержит 40 МЕ. Составив пропорцию:

0,4 мл - 40 МЕ

1 мл - х МЕ и умножив полученное значение на степень разведения (*10), получаем х = (40/0,4)*10=1 000 МЕ/мл - титр сыворотки.

По такому же принципу проводят титрование анатоксина (по известной антитоксической сыворотке).