Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза

Введение

Совершенствование лабораторный диагностики туберкулеза, в частности сокращение сроков и повышение точности выявления МБТ, является одной из приоритетных задач противотуберкулезной работы. 

Применение новых лабораторных методов позволяет вывить большее число больных туберкулезом на ранних этапах заболевания, сократить время диагностики и определения лекарственной чувствительности МБТ, назначить адекватную химиотерапию и, как результат, снизить распространенность заболевания.

Исследования генома микобактерий позволили установить специфические для МБТ участки ДНК, такие как вставочный элемент IS6110, и определить мутации в гене rpoB, отвечающие за развитие устойчивости к противотуберкулезному препарату рифампицину. Полная расшифровка генома МБТ в 1998 г. послужила основой для разработки новых методов быстрой диагностики туберкулеза, лекарственной чувствительности микобактерии и определения индивидуальной структуры ДНК (ДНК-дактилоскопия) с использованием молекулярно-генетических методов. 

Одним из основных компонентов стратегии ВОЗ «Ликвидировать туберкулез» является ранняя диагностика заболевания и тестирование лекарственной чувствительности МБТ у всех пациентов. Неотъемлемой частью данной стратегии является разработка и внедрение в практику новых, а также совершенствование существующих методов лабораторной диагностики. 

Ассамблея ВОЗ объявила о создании в 2003 г. Фонда инноваций новой диагностики (FIND). Фонд является международной некоммерческой организацией, которая участвует в разработке и внедрении диагностических тест-систем. Основным направлением деятельности FIND является создание современных диагностических методов выявления МБТ, так как микроскопия и культуральные исследования, широко использующиеся в практической деятельности в ХХ веке, не позволяют своевременно и эффективно выявлять все случаи туберкулеза. Фонд активно сотрудничает с научно-исследовательскими институтами, научными сообществами, министерствами здравоохранения разных стран, коммерческими партнерами, ВОЗ и центрами клинических испытаний.

В настоящее время лабораторная диагностика туберкулеза должна решать следующие задачи: 

• выявление МБ

• видовая идентификация микобактерий

• определение лекарственной чувствительности МБТ

• молекулярно-эпидемиологический анализ

• диагностика латентного туберкулеза 

Данные, полученные в результате работы по каждому из пяти направлений, необходимы для ежедневной работы противотуберкулезной службы, а решение всех задач повысит ее эффективность. Отсутствие каких-либо компонентов лабораторной диагностики в алгоритме обследования больных туберкулезом может негативно сказаться на результатах лечения и эпидемиологических показателях в целом.

Обнаружение микобактерий позволяет с высокой степенью достоверности подтвердить диагноз «туберкулез» и назначить соответствующий стандартный режим лечения. Выявление больного-бактериовыделителя, являющегося источником инфекции, - одно из приоритетных мероприятий по предупреждению дальнейшего распространения заболевания. 

Идентификация видовой принадлежности микобактерий позволяет верифицировать диагноз, и при необходимости, корректировать лечение при обнаружении, например, нетуберкулезных микобактерий (НТМБ). 

Определение лекарственной чувствительности МБТ - неотъемлемая часть обследования каждого больного туберкулезом, так как с учетом полученных результатов назначают стандартные эффективные режимы химиотерапии. 

Анализ эпидемиологических процессов с помощью молекулярно-генетических методов позволяет достоверно установить путь передачи инфекции как в отдельно взятом случае, так и в популяции, выявить случаи внутрибольничного инфицирования, определить механизмы повторного развития туберкулеза (реинфицирование или реактивация) и выявить факторы риска возникновения заболевания. 

Методы микроскопии

Основным преимуществом микроскопии является относительная простота выполнения, короткие сроки получения результата и низкие экономически затраты.  Выполнение микроскопии мазка диагностического материала для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) не требует специального дополнительного оснащения лабораторий, его проведение возможно и в медицинских организациях, оказывающих первичную медико-санитарную помощь, и в центральных бактериологических лабораториях. 

Качественное выполнение методики с соблюдением всех рекомендаций и нормативов позволяет выявлять около 50% больных туберкулезом легких, применением светодиодной (LED) микроскопии позволяет улучшить данный показатель.

Запомните: если пациента беспокоит продуктивный кашель более двух недель обязательно надо исследовать мокроту на наличие кислотоустойчивых микобактерий!

Как правильно собрать мокроту, чтобы исследовать ее на туберкулез?

Действительно, есть определенные правила, чтобы собрать качественный материал (мокроту) для исследования на туберкулез

Собирают как минимум две порции мокроты в два контейнера с интервалом в несколько часов

Лучше, если обе порции будут собраны утром – в день обращения и на следующий день, или хотя бы одна из двух порций должна быть утренней

Мокроту надо собирать только в специальном кабинете или специальной кабине, чтобы не допустить заражения микобактериями туберкулеза других пациентов и медицинский персонал, и с соблюдением мер инфекционной безопасности, под контролем медицинского работника. 

Собранную мокроту как можно быстрее доставляют в клинико-диагностическую лабораторию, где после обработки и окрашивания специальным методом (по Цилю-Нильсену) проводят исследование приготовленных мазков под микроскопом. 

Исследование занимает не более двух часов; как правило, врач, его назначивший, получает результат на следующий день.

Таким образом,  у врача будут и результаты исследования мокроты на КУМ, и лучевого исследования органов грудной клетки. Данные могут быть следующие:

• В мокроте обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, а в легких – патологические изменения

• В мокроте кислотоустойчивые микобактерии не обнаружены, в легких выявлены патологические изменения

• В мокроте кислотоустойчивые микобактерии не обнаружены, в легких патологических изменений не выявлено

В первом случаев диагноз туберкулеза весьма вероятен, но это также может быть заболевание, вызванное нетуберкулезными микобактериями – микобактериоз, которое в настоящее время стало встречаться все чаще. Для того, чтобы поставить верный диагноз и назначить правильное лечение, обязательно необходимо исследовать мокроту молекулярно-генетическими методами, и, если будут выделены ДНК МБТ – это туберкулез, если ДКН НТМБ (нетуберкулезных микобактерий) – это микобатериоз.

Если в правильно собранных образцах мокроты не обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, а в легких выявлены изменения, то это могут различные другие заболевания, например, пневмония, онкологическая патология, системное заболевание с поражением легких и иные. В такой ситуации проводят дополнительное обследование, при необходимости назначают КТ-исследование органов грудной клетки, консультацию различных специалистов, в том числе врача-фтизиатра. 

Так, во втором случае мы не можем исключить диагноз туберкулеза, для этого требуется проведение дополнительных дифференциально-диагностических мероприятий и исследование мокроты молекулярно-генетическими методами, которые позволяют обнаружить даже небольшое количество микобактерий. 

В третьем случае туберкулез легких исключен.

Молекулярно-генетические методы

Какой лабораторный метод лучше? Зачем надо исследовать мокроту несколькими методами?

Обратите внимание, что метод исследования мокроты под микроскопом для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) имеет довольно низкую чувствительность и позволяет выявить не более 50% больных туберкулезом, но именно эти пациенты и представляют эпидемическую опасность! Если у пациента с туберкулезом в мазке мокроты находят микобактерии, это значит, что в одном миллилитре материала находится около 5 000- 10 000 бактерий

Молекулярно-генетические методы отличаются высокой чувствительностью: для выделения ДНК возбудителя туберкулеза достаточно нескольких (5-10) микобактерий в одном миллилитре мокроты, а также высокой специфичностью

В настоящее время быстрые (несколько часов) и достоверные молекулярно-генетические методы выявления туберкулеза выполняются только в лабораториях противотуберкулезных медицинских организаций, но уже появились рекомендации ВОЗ о необходимости их проведения на уровне организаций, оказывающих первичную медико-санитарную помощь, и многие страны Европы начали осуществлять такую диагностику. При обращении за медицинской помощью пациента с подозрением на туберкулез легких сначала выполняют молекулярно-генетическое исследование мокроты, а при обнаружении ДНК МБТ – исследование мазков мокроты для определения эпидемической опасности больного

Фенотипические (культуральные) методы

С целью повышения точности лабораторной диагностики выполняются посевы диагностического материала на питательные среды. Основным преимуществом культуральных исследований является их высокая чувствительность, позволяющая выявлять даже небольшое количество бактерий: от 10 МБТ в одном мл материала, однако получить результаты исследования возможно только через несколько дней, а иногда и недель. 

Для этого существуют различные технологии, созданы автоматизированные системы с жидкими питательными средами, позволяющие получить результат в течение 14 – 42 дней Сегодня практически утратил свою значимость для диагностики туберкулеза посев диагностического материала на плотные питательные среды, когда для получения результата необходимо от 21 до 90 дней.

Уважаемые слушатели! Для успешного освоения темы и для ответов на тестовые задания предлагаем ознакомиться с дополнительной литературой, которая расположена в материалах курса и посмотреть учебный фильм "Лабораторная диагностика туберкулеза", который снят в Архангельском клиническом противотуберкулезном диспансере, где проводятся все современные методы выявления и верификации заболевания (ссылка)