Бут вірус лаб 15

Лабораторна робота №15

Тема: реакція зв’язування комплементу

Мета: ознайомити студентів із використанням РЗК у вірусології на прикладі визначення типу вірусу ящуру.

Зміст роботи:

1. Основні відомості про РЗК.

Реакція зв’язування комплементу (РЗК) — одна з традиційних серологічних реакцій, які застосовують для діагностики багатьох вірусних хвороб (ящуру, аденовірусної, респіраторно-синцитіальної, ротавірусної інфекції великої рогатої худоби та ін.). РЗК використовують для ідентифікації вірусів, а також для виявлення й титрування антитіл у сироватках крові. Реакція відбувається в два етапи. На першому етапі у реакції беруть участь антиген і антитіло (один з цих інгредієнтів заздалегідь відомий), а також певна кількість попередньо відтитрованого комплементу. За гомологічності антигену й антитіла їх комплекс зв’язує комплемент, що виявляють на другому етапі за допомогою індикаторної гемосистеми: суміш еритроцитів барана й антисироватки до них — гемолізину. Якщо комплемент зв’язався під час и.тємодії антигену й антитіла, то лізис еритроцитів не відбувається (позитивна РЗК). За негативної РЗК не зв’язаний комплемент сприяє гемолізу еритроцитів. Основними компонентами РЗК є антигени, антитіла (відомі антисироватки чи досліджувані сироватки), комплемент, гемолітична сироватка й еритроцити барана в ізотонічному розчині NaCl (pH = 7,2 - 7,4). Антигени для РЗК готують із тканин і органів хворих тварин, з млантоїсної чи амніотичної рідини заражених курячих ембріонів, а також із культуральної рідини інфікованих культур клітин. Тому препарати вірусних антигенів містять багато баластних білків субстрату, які здатні адсорбувати комплемент за відсутності гомологічних антитіл. Це затримує гемоліз і спотворює результати реакції. Від антикомплементарних компонентів антигени очищають ацетоном, фреоном, хлороформом, ефіром, метанолом, етанолом, а таож багаторазовим заморожуванням-розморожуванням. Сироватки також мають антикомплементарні властивості. Від них та від неспецифічних інгібіторів сироватки позбавляють нагріванням (56 — 60 °С) або попередньою обробкою комплементом (на З об’єми сироватки добавляють 1 об’єм комплементу, інкубують упродовж 16 - 18 год при 4 °С і впродовж ЗО хв при 37 °С) з наступним прогріванням.

2. Підготовка й титрування гемолізину.

Гемолізин титрують після отримання його нової серії за загальноприйнятою методикою. І Біофабрики іноді виробляють гемолізин, консервований гліцерином 1 :1, тому для розбавляння гемолізину 1 : 100 беруть 0,2 мл гемолізину та 9,8 мл фізіологічного розчину; з цього розбавляння готують основне розбавляння 1:1000 (до 1 мл гемолізину 1:100 добавляють 9 мл фізіологічного розчину). Із основного розбавляння (1:1000) готують усі наступні. Отримавши необхідні розбавляння гемолізину, виконують його титрування за схемою. У результаті титрування встановлюють титр гемолізину, тобто його мінімальну кількість, здатну спричинити лізис еритроцитів (гемоліз) за участю комплементу. За наведеною схемою ця кількість гемолізину міститься в розбавлянні 1:3000. Для головного досліду беруть гемолізин у 4-разовій концентрації під його титру - робоче розбавляння. Наприклад, за титру гемолізину 1:3000 його робоче розбавляння буде 1:750. А якщо він консервований гліцерином 1:1, то для приготування робочого розбавляння беруть 2: 750, чи 0,2 мл цільного гемолізину і 74,8 мл фізіологічного розчину.

3. Приготування 2%-ї суспензії еритроцитів барана.

До 2 мл осаду відмитих еритроцитів добавляють 98 мл фізіологічного розчину. Приготовлену суспензію еритроцитів барана використовують для отримання гемосистеми.

4. Приготування гемолітичної системи (гемосистеми).

Змішують гемолізин у робочому розбавлянні з таким самим об’ємом 2%-ї суспензії еритроцитів барана. Перед використанням гемосистему витримують упродовж ЗО хв у термостаті для сенсибілізації еритроцитів.

5. Титрування комплементу.

Комплемент титрують у день проведення головного досліду в гемолітичній системі за певною схемою. Титром комплементу вважають його мінімальну кількість, необхідну для повного гемолізу еритроцитів (в умовах проведення РЗК). Для проведення головного досліду РЗК беруть комплемент у робочому титрі, що на 1 % вищий за вихідний. Зазвичай використовують комплемент із робочим титром не менш як 2,5 %. Наприклад, за даними табл. титр комплементу дорівнює 2 %. Тоді для приготування комплементу в робочому титрі беруть 3 мл нативного цільного комплементу й добавляють до нього 97 мл фізіологічного розчину. Для нормального перебігу реакції та забезпечення вірогідності результатів необхідно правильно визначити й підібрати робочу дозу комплементу. Надлишок комплементу спричинює часткову чи повну втрату можливості виявити специфічний антиген або антитіло. Нестача комплементу затримує гемоліз, що також може зумовити неправильний результат аналізу.

6. Приготування досліджуваного антигену.

Патологічний матеріал від хворих тварин відмивають фізіологічним розчином (pH = 7,4 - 7,6) від консерванту, висушують фільтрувальним папером, зважують, подрібнюють і ретельно розтирають у порцеляновій ступці зі стерильним битим нейтральним склом до отримання однорідної маси. До неї добавляють подвійну кількість фізіологічного розчину. Отриману 33%-ву суспензію центрифугують при 3-5 тис. об/хв впродовж 30-15 хв. Надосадову рідину інактивують при 58 °С упродовж 40 хв. Якщо рідина містить пластівці, її повторно центрифугують при З тис. об/хв впродовж 10 - 15 хв і використовують як антиген у РЗК. Досліджуваний антиген для проведення реакції використовують цільним (33%-ва суспензія, отримана з патологічного матеріалу) і в розбавляннях 1:2;1:4; 1:8. Типоспецифічні антигени, які випускають біофабрики, використовують у робочому титрі, що являє собою подвійний вихідний титр. Наприклад, на етикетці зазначено титр 1 : 6. Отже, подвійний титр становитиме 1 : 3. Позитивні типоспецифічні сироватки також використовують у подвійних титрах. Так, якщо титр сироватки, зазначений на етикетці, дорівнює 1 : 40, то робочий титр становитиме 1 : 20.

7. Проведення головного досліду РЗК (на прикладі визначення типу вірусу ящуру).

Одночасно з головним дослідом ставлять контроль усіх специфічних антигенів і сироваток відповідно до схеми. Компоненти вносять у пробірки в такому порядку:

1) специфічні сироватки в робочому титрі — по 0,2 мл для кожної сироватки, один ряд пробірок по вертикалі;

2) специфічні антигени в робочому титрі — по 0,2 мл для кожного антигену, один ряд пробірок по горизонталі;

3) випробуваний антиген у розбавляннях — по 0,2 мл для кожного розбавляння, один ряд пробірок по горизонталі;

4) фізіологічний розчин — по 0,2 мл в останній ряд пробірок горизонталі замість антигену (контроль сироваток) і в останній ряд пробірок по вертикалі замість сироваток (контроль антигенів);

5) комплемент — по 0,2 мл у робочому розбавлянні в усі пробірки головного досліду.

6) Пробірки обережно струшують і вмішують на 20 хв у водяну лазню при 37 °С; після інкубації в усі пробірки вносять по 0,4 мл гем літичної системи. Пробірки знову струшують і ставлять у водяну баню на 30 хв при 37 °С. Облік результатів реакції здійснюють через 5 — 10 хв після водяної бані, остаточний результат отримують через 10 — 12 год, Ступінь затримки гемолізу оцінюють у плюсах: (++++) — 100%-на затримка гемолізу; (+++) — 75%-ва; (++) — 50%-ва; (+) — 25%-ва затримка гемолізу; (—) — повний гемоліз. Якщо випробуваний антиген гомологічний специфічним антитілам, то спостерігатиметься затримка гемолізу. Реакцію оцінюють а позитивну. Якщо ж гомологічні антитіла відсутні, то спостерігається повний гемоліз. Реакцію вважають негативною.