Бут вірус лаб 14
.docxЛабораторна робота №14
Тема: реакція нейтралізації.
Мета: опанувати методику проведення реакції нейтралізації.
Зміст роботи:
Опанування методу нейтралізації стандартного вірусу невідомою сироваткою.
Основні принципи реакції нейтралізації. Реакція нейтралізації ґрунтується на здатності специфічних антитіл блокувати (нейтралізувати) інфекційну активність відповідного вірусу. Індикатором вільного вірусу, який не нейтралізовано, є чутлива до вірусу біологічна система: лабораторні тварини, курячі ембріони або культура клітин. Реалізація всіх етапів проведення реакції нейтралізації потребує чіткого дотримання стерильності. Через те що антитіла та антигени взаємодіють у певних кількісних співвідношеннях, реакцію нейтралізації ставлять у двох модифікаціях:
з постійною дозою вірусу (100 або 1000 ЕД50/см3 ) та з різними розбавляннями сироватки;
з постійним розбавлянням сироватки та різними дозами вірусу. З метою діагностики вірусних захворювань частіше використовують першу модифікацію реакції.
Проведення реакції нейтралізації на культурі клітин з метою ідентифікації вірусу.
Визначення 1 ТЦЦ5о і приготування робочої дози вірусу. Готують 10-разові розбавляння вірусовмісного матеріалу Розбавляннями вірусу заражають культуру клітин у 4-разовій повторності (по 4 флакони). Для цього із флаконів, що містять культуру клітин, зливають середовище, у кожний вносять по 0,1 мл вірусовмісного матеріалу у визначеному розбавлянні. На 6 розбавлянь вірусу, наприклад, потрібно 24 флакони з культурою клітин і 4 флакони з культурою клітин для контролю, з яких зливають середовище, але не вносять у них вірус. Усі флакони залишають у горизонтальному положенні за кімнатної температури на термін від 40 хв до 2 год для адсорбції вірусу на клітинах. Потім у всі флакони добавляють 1 см3 підтримувального живильного середовища й переносять їх на інкубацію в термостат при 37 °С. Через дві доби інкубації флакони щодня мікроскопують, відзначаючи ЦПД вірусу в повторностях і розбавляннях. Титр вірусу обчислюють за формулами Ріда й Менча або Кербера. За робочу дозу вірусу у PH прийнято брати 100 або 1000 ТЦД50/см3 . Отже, розраховане за формулами розбавляння вірусу, що відповідає 1 ТЦД50, потрібно помножити на 100 або 1000 й приготувати відповідне розбавляння вірусу. Це буде робоча доза вірусу.
Розрахувати титр специфічних антитіл.
Ідентифікація вірусу за допомогою специфічної сироватки. Сироватки, специфічну (SS) і контрольну негативну (SN), взяті з діагностикуму на передбачувану вірусну інфекцію, розбавляють відповідно до інструкції підтримувальним живильним середовищем для культури клітин і звільняють від термолабільних інгібіторів прогріванням упродовж ЗО хв за відповідних температур: для морської свинки, великої рогатої худоби, коней, людини — 56 °С; для курей — 58 °С; для кролика, білих пацюків — 60 °С; для свиней та овець — 62 °С. У стерильних пробірках на підтримувальному живильному середовищі готують дворазові розбавляння сироваток, наприклад, в об’ємі 2 см3 кожного розбавляння. Кількість розбавлянь повинно перевищувати титр специфічної сироватки на одне розбавляння. До кожного розбавляння сироваток добавляють такий самий об’єм (2 см3 ) вірусу (АГД у робочій дозі. Готують контролі: для сироватки (2 CM3 SS або SN і 2 см3 середовища), для вірусу (2 см3 АГХ і 2 см3 середовища), для середовища (4 см3 середовища). Суміші вірусу з розбавляннями сироваток і контролі витримують за певної температури від ЗО хв до 18 год залежно від властивостей вірусу, для того щоб антитіла сироватки встигли нейтралізувати вірус. Кожною сумішшю заражають культуру клітин (по 4 флакони) за вище викладеною методикою, інкубують у термостаті за температури 37 °С. Через дві доби мікроскопуванням починають виявляти результати реакції за ЦПД вірусу в культурі клітин, фіксуючи їх у таблиці. Той факт, що за наявності чіткої ЦПД у негативному контролі з нормальною сироваткою SN специфічна сироватка SS в малих розбавляннях нейтралізує вірус, завдяки чому він уже не чинить цитопатичної дії на культуру клітин, підтверджує гомологічність цієї сироватки вірусу АГ. Це означає, що вірус ідентифіковано.