Бут вирус лаб 11

Лабораторна робота 11

Тема: культивування вірусів в курячих ембріонах, що розвиваються. Розтин курячих ембріонів.

Мета: опанувати методи культивування вірусів у курячих ембріонах.

Зміст роботи:

1. Ознайомитись з правилами роботи  з курячими ембріонами.

Підготовка курячих ембріонів до зараження вірусом:

1. Із господарства доставляють 5 - 6-денні курячі ембріони, не допускаючи їхнього охолодження.

2. Планшети з курячими ембріонами вміщують у термостат за температури 37,5 - 38,5 °С і вологості 60 - 80 %, для чого в термостат ставлять чаші з водою й відкривають вентиляційні отвори. Можна вирощувати курячі ембріони в термостаті, закладаючи запліднені яйця, що зберігалися не більш як 10 діб.

3. Перед зараженням курячі ембріони овоскопіюють. Відмічають олівцем межу повітряної камери, місцезнаходження зародка (темна рухлива пляма) і ділянку безсудинної зони 0,5 х 0,5 см. Ці орієнтири дають змогу визначитися щодо методу зараження курячих ембріонів вірусовмісним матеріалом. Овоскопія надає можливості для відбору живих курячих ембріонів із кровонаповненими судинами та активною рухливістю.

4. Заражають курячі ембріони в асептичних умовах. їх фіксують на металевій підставці, яку розміщують на емальованій кюветі з трьомачотирма шарами марлі, просоченої дезінфекційним розчином.

5. На кювету ставлять спиртівку, стерилізатор з стерильними інструментами, банку з йодованим спиртом (кристалічний йод, розчинений у спирті), пробірку з ватяним тампоном, намотаним на металеву спицю й змоченим спиртом.

6. Роботу виконують в асептичних умовах, у боксі. Курячі ембріони обробляють йодованим спиртом за допомогою ватяного тампона на спиці, а потім фламбують їх запаленим тампоном-факелом.

2. Ознайомитись з основними методами зараження КЕ.

Зараження в алантоїсну порожнину:

Варіант 1.

1. Ембріон фіксують на підставці повітряною камерою догори.

2. На боці зародка або з протилежного зародку боку бияком роблять отвір для голки на 0,5 см вище від межі камери.

3. Вводять у нього голку шприца вертикально на глибину 10 — 12 мм і вносять суспензію вірусу.

4. Після витягування голки отвір закривають краплею розплавленого парафіну.

Варіант 2.

1. Для виходу повітря роблять отвір у шкаралупі над центром повітряної камери.

2. Другий отвір роблять у шкаралупі з боку зародка в безсудинній зоні.

3. Голку вводять на глибину 2 — 3 мм, ін’єктують вірусовмісний матеріал і закривають отвір парафіном.

Зараження на хоріоналантоїсну оболонку:

Варіант 1.

1. У разі зараження ембріонів через штучну повітряну камеру, попередньо у шкаралупі над центром природної повітряної камери роблять отвір бияком.

2. Ембріони кладуть на підставку горизонтально, знімають шкаралупу площею 0,4 — 0,5 см2 , не пошкоджуючи ХАО, просуванням голки порушують підшкаралупову оболонку.

3. Крізь дефект, що утворився, має проходити повітря. Гумовою грушею крізь отвір над центром повітряної камери відсмоктують повітря, внаслідок чого повітря проходить через пошкоджену підшкаралупову оболонку (вилучена ділянка). У цьому місці ХАО опускається й створюється штучна повітряна камера, в яку вносять вірусовмісний матеріал.

4. Бічний отвір у шкаралупі закривають лейкопластиром, а отвір над повітряною камерою закривають парафіном або залишають відкритим. Такі ембріони інкубують у горизональному положенні.

Варіант 2.

1. У разі зараження курячих ембріонів через природну повітряну камеру їх вміщують на підставку повітряною камерою догори,

2. у центрі її роблять вікно в шкаралупі діаметром 1,0 - 1,5 см. 3. Стерильним пінцетом через вікно знімають ділянку підшкаралупової оболонки й на ділянку ХАО, що відкрилася, наносять вірусовмісний матеріал. Вікно в шкаралупі закривають лейкопластиром або покривним скельцем, заливаючи його краї розплавленим парафіном.

3. Ознайомитись з основними правилами розтину та відбору вірусвмістимого матеріалу.

Розтин курячих ембріонів здійснюють із метою виявлення ознак розмноження вірусу в них і відбору вірусовмісного матеріалу. Залежно від тропізму вірус може накопичуватися в максимальній кількості в тканинах зародка, хоріоналантоїсній оболонці, стінках жовткового мішка, алантоїсній та амніотичній рідинах. Ці структури й відбирають як вірусовмісний матеріал. Найбільш зручним є отримання екстраембріональної рідини (алантоїсної та амніотичної), оскільки вона є готовою суспензією вірусу.

1. Розтинають курячі ембріони в стерильному боксі на кюветі з чотирма шарами марлі, просоченої дезінфекційним розчином. На кюветі є стерилізатор зі стерильними інструментами, підставка з курячими ембріонами, баночка з йодованим спиртом, пробірка з ватяним тампоном на спиці, спиртівка.

2. Шкаралупу протирають тампоном, змоченим йодованим спиртом, і фламбують.

3. Ножицями зрізують шкаралупу над повітряною камерою (природною чи штучною), дещо вище від її межі.

4. Оглядають оголену хоріоналантоїсну оболонку з метою виявлення патологоанатомічних змін, якщо вірус наносили на неї. У місці нанесення вірусу спостерігаються найбільш різкі зміни. Цю ділянку ХАО піднімають пінцетом, зрізують ножицями, кладуть у чашку Петрі з фізіологічним розчином, промивають і використовують для наступної ідентифікації вірусу.

5. Іншу частину ХАО оглядають, знявши залишок ХАО з підшкаралупової оболонки в стерильну чашку Петрі з фізіологічним розчином і попередньо вилучивши зародок, жовтковий мішок і білок. Для цього ХАО ополіскують, двома пінцетами розпрямляють у чашці Петрі, під яку підкладено чорний папір, і на його тлі розглядають білуваті вузлики — ураження хоріоналантоїсної оболонки вірусом. Ці ураження також можна використовувати в процесі ідентифікації вірусу.

6. У разі попереднього зараження курячих ембріонів у жовтковий мішок вміст із жовтковим мішком виливають у чашку Петрі. Жовтковий мішок розрізають, промивають фізіологічним розчином і кладуть у стерильний флакон.

7. Якщо курячі ембріони заражали в алантоїсну порожнину, то після видалення шкаралупи над природною повітряною камерою піпеткою проколюють підшкаралупову оболонку, ХАО за тілом зародка і за допомогою груші відсмоктують алантоїсну рідину (до 10 мл), фіксуючи пінцетом зародок. Зливають рідину в стерильний флакон.

8. У разі зараження в амніотичну порожнину як вірусовмісний матеріал беруть амніотичну рідину, яку відсмоктують стерильною піпеткою з амніотичної порожнини, підтягнувши амніотичну оболонку до відкритої повітряної камери. Тіло зародка витягують пінцетом, утримуючи його за шию.