Бут вирус лаб 10

Лабораторна робота 10

Тема: культивування вірусів  у клітинних культурах. Титрування вірусів.

Мета: опанувати методику культивування вірусів у клітинних культурах.

Зміст роботи:

1. Опанування методу  культивування вірусу у клітинних культурах СНЕВ.

Зараження культури клітин вірусом:

1. Флакони, пробірки або матраци з суцільним моношаром клітин відбирають, досліджуючи їх за малого збільшення мікроскопа.

2. Відібрані посудини з культурою клітин переносять у стерильний бокс, де живильне середовище зливають, а моношар 1-2 рази промивають розчином Хенкса для видалення сироваткових антитіл та інгібіторів.

3. У 4-10 пробірок (флаконів) стерильною піпеткою з грушею вносять по 0,1 — 0,2 мл вірусовмісного матеріалу, у матраци — у кількості 1 - 1,5 % їх об’єму. Рівномірно погойдуючи, розмішують його по моношару.

4. У кілька пробірок вірус вносять і залишають їх як контроль. Контрольні й дослідні пробірки з вірусом вкладають рискою догори у штатив під кутом 5° на І 2 год за кімнатної температури або при 37 °С для адсорбції вірусу на клітинах. Потім зливають залишки вірусовмісного матеріалу і вносять у пробірки по 1 - 2 см3 підтримувального середовища з антибіотиками, а в матраци — 10 — 15 % їхнього об’єму.

5. Якщо є підозра, що вірусовмісний матеріал може бути токсичним (наприклад, суспензія, отримана із вмісту кишок хворої чи загиблої і марини), моношар клітин перед внесенням підтримувального середовища 1-2 рази відмивають розчином Хенкса.

6. Після герметичного закупорювання гумовими корками матраци в горизонтальному положенні, а пробірки — рискою догори розміщують на спеціальних штативах чи планшетах під кутом 5° так, щоб моношар клітин знаходився під живильним середовищем, та інкубують у термостаті за температури 37 °С, щодня розглядаючи за допомогою мікроскопа стан контрольних та заражених зразків.

7. Живильне підтримувальне середовище в посудинах із культурою клітин, заражених вірусом, зазвичай не міняють упродовж 7 діб, підтримуючи pH = 6,9 - 7,4 додаванням 7,5%-го розчину NаНСОз.

2. Розрахувати титр вірусу, що був отриманий на КК СНЕВ.

Титрування вірусів за інфекційною дією зі статистично оцінюваним ефектом. У лабораторній практиці як чутливі до вірусів живі системи використовують лабораторних тварин, курячі ембріони і культури клітин. Ступінь чутливості цих об’єктів до вірусів різна. Якщо заразити навіть високовірулентним штамом велику кількість живих систем, 100%-й інфекційний ефект зумовити не вдається. Наприклад, як показали дослідження, у разі зараження значної кількості білих мишей вуличним вірусом сказу приблизно 16% тварин залишаються клінічно здоровими або виживають з ознаками паралічів, тремору та млявості (абортивна інфекція). Це саме стосується й інших живих об’єктів. У зв’язку з цим інфекційний титр вірусів здебільшого може бути визначений як статистична величина. За одиницю інфекційного титру прийнято 50%-ву ефективну доза — ЕД50. Це доза вірусу, яка спричинює інфекційний ефект у 50% заражених живих систем. Чому за одиницю інфекційного титру взято дозу вірусу, яка зумовлює саме 50%-й інфекційний ефект, а не інакший (наприклад, 20%-й чи 70%-й)? ЕД5о є найстійкішою порівняно з іншими, тому прийнята за умовну одиницю інфекційного титру. ЕД50 — це збірне поняття. Залежно від виду тест-об’єкта і форми прояву інфекційного ефекту ЕД5о називають по-різному в кожному конкретному випадку (табл.).

Методика визначення ЕД50:

1. Готують ряд послідовних 10-разових розбавлянь вірусу на фізрозчині або розчині Хенкса, або середовищі для культури клітин (залежно від виду тест-об’єкта).

2. Для цього в кілька пробірок вносять 9 частин фізрозчину,

3. В першу добавляють 1 частину вірусу, перемішують триразовим піпетуванням і переносять 1 частину в наступну пробірку і т. д. Кожне розбавляння вірусу готують новою піпеткою. Ступінь розбавляння вірусу залежить від його вихідної концентрації, що передбачається.

4. В останніх розбавляннях інфекційна дія вірусу не повинна виявлятися. Чому готують саме 10-разові розбавляння? Тому що існує пряма Тест-об’єкт Інфекційна дія вірусів Назва ЕД50 Лабораторні тварини Загибель Клінічні ознаки або патологоанатомічні зміни ЛД50 — 50%-ва летальна доза ІД50 — 50%-ва інфекційна доза Курячі ембріони Загибель Патологоанатомічні зміни ЕЛД50 — 50%-ва ембріональна летальна доза ЕІД50 — 50%-ва ембріональна інфекційна доза Культура клітин Цитопатичний ефект ЦД50 (або ТЦД50) — 50%-ва цитопатична доза (або 50%-ва тканинна цитопатична доза) залежність між 10-разовими розбавляннями вірусу та його інфекційною дією. Крім того, при 10-разових розбавляннях зручніше проводити подальші розрахунки.

5. Кожним розбавлянням вірусу в однаковому об’ємі заражають однакову кількість чутливих до цього вірусу тест-об’єктів (не менше 4).

6. За зараженими тест-об’єктами спостерігають певний час (5 – 12 діб), враховують результати дії вірусу (загибель, клінічні ознаки, патологоанатомічні зміни чи ЦПД).

7. Розбавляння вірусу, яке спричинює 50%-й інфекційний ефект, розраховують статистичними методами, найчастіше за методом Ріда і Менча або методом Кербера.

8.Після того як визначили розбавляння вірусу, що містить 1 ЕД5о, визначають, скільки ЕД50 містить такий самий об’єм нерозбавленого вірусу. Потім перераховують кількість ЕД50 на 1 мл вірусовмісного матеріалу, що й буде показником титру вірусу.

Титрування вірусів за методом Ріда і Менча:

1. Протитрувати вірус ектромелії (віспи мишей) на білих мишах, заражаючи їх внутрішньочеревно в об’ємі по 0,5 мл по 6 мишей на одне розбавляння вірусу; титр вірусу визначити в ЛД50.

2. Метод Ріда і Менча ґрунтується на використанні кумулятивних даних, їх отримують, виходячи з припущення, що миша, яка вижила при зараженні високою дозою вірусу, тим більше виживе від меншої дози, і, навпаки, тварина, що загинула від низької дози вірусу, тим більше загине від вищої дози.

3. Виходячи з таких міркувань, підсумовують фактичні дані.

4. Спочатку отримують кумулятивні дані відносно тварин, що вижили, додаючи їх кількість від більших доз вірусу до менших (І). Від зараження вірусом у розбавлянні ІО" 1 жодна миша не вижила, а в розбавлянні 10~ 2 вижила одна. Ці цифри переписують у відповідну графу кумулятивних даних, оскільки немає що підсумовувати. Від зараження в розбавлянні 10_3 фактично вижило 2 мишки плюс та одна, що вижила від більшої дози вірусу (10-2 ), разом їх буде 3. Від розбавляння 10-4 фактично вижило 4 мишки плюс 1 і 2, які вижили від більших доз (10-2 і 10_3), разом їх буде 7. Від розбавляння 10 5 фактично вижило 6 мишок плюс 1, 2 і 4, які вижили від більших доз (10_3 і 10-4 ), разом їх буде 13. А при розбавлянні 10~6 , якщо скласти всі фактичні дані, отримаємо 19 мишей. Потім обчислюють відсоток летальності для кожного розбавляння вірусу.