Бут вирус лаб 8

Лабораторна робота 8

Тема: первинні клітинні культури. Одержання первинно-трипсинізованої культури клітин.

Мета: опанувати методику отримання первинно-трипсинізованих клітинних культур з курячого ембріону.

Хід роботи:

1. Опанування методу теплової трипсинізації тканин курячого ембріону.

І. Методика отримання первинно-трипсинізованої культури клітин із тканин курячого ембріона.

1. Усю роботу з клітинними культурами виконують у стерильних боксах.

2. За допомогою овоскопа відбирають життєздатні курячі ембріони 9 —11- денного віку, відмічають простим олівцем межу повітряної камери й зародок.

3. Переносять їх у бокс і розміщують на підставці для ембріонів, поверхню шкаралупи протирають ватяним тампоном, змоченим йодованим спиртом, і фламбують.

4. Стерильними ножицями зрізують шкаралупу на 2 - 3 мм вище від межі повітряної камери й стерильним пінцетом, розірвавши підшкаралупову й хоріоналантоїсну оболонки, витягують за шийку ембріон і кладуть у стерильну чашку Петрі.

5. За допомогою ножиць і пінцета видаляють голову, лапки, крила й внутрішні органи ембріона. Шкірно-м’язову тканину переносять у стерильну банку й подрібнюють ножицями на шматочки розміром 2 — 3 мм.

6. Подрібнену тканину 2-3 рази відмивають від крові й слизу розчином Хенкса до отримання прозорого розчину.

7. Отриману масу переносять у стерильну колбу з магнітом, попередньо замінивши ватяну пробку на гумову. Тканину заливають 0,25%-м розчином трипсину, підігрітим до 35 - 37 °С, щоб шматочки були покриті розчином заввишки 10 - 15 мм (співвідношення тканини й трипсину 1:3) .

8. Колбу ставлять на магнітну мішалку на 5-7 хв до появи опалесценції, завись клітин у трипсині зливають у склянку. У колбу додають нову порцію підігрітого трипсину, тканину знову трипсинізують 5 — 7 хв. Клітинну суспензію разом із трипсином зливають у стерильний флакон, який ставлять у холодильник за температури 4 °С для припинення дії трипсину на клітини. Трипсинізацію проводять при 37 °С дробно, кілька разів (до повного розщеплення тканини). 9. Надосадову рідину зливають, а до осаду стерильною піпеткою з грушею добавляють невелику кількість ростового живильного середовища, що містить 10 % сироватки крові великої рогатої худоби. Осад клітин ресуспендують у живильному середовищі, суспензію фільтрують у колбу крізь потрійний шар стерильної марлі. Потім лійку в колбі змінюють на стерильну гумову пробку й відбирають 1 мл суспензії з метою підрахунку клітин у камері Горяева.

II. Методика визначення концентрації клітин у суспензії.

1. До 1 мл відібраної суспензії клітин добавляють такий самий об’єм 0,1%- го кристалвіолету на 0,1 н розчині лимонної кислоти. Після перемішування забарвленою суспензією клітин заповнюють камеру Горяева й підраховують усі клітини з ядром та неушкодженою цитоплазмою; якщо трапляються групи клітин із чітко окресленими контурами, їх вважають однією клітиною.

2. Підраховують клітини в двох камерах, знаходять середнє арифметичне для камери й визначають кількість клітин в 1 мл суспензії (X) за формулою Х = ( А - 2 • 1000) : 0,9, де А — середня кількість клітин в одній камері; 2 — коефіцієнт розбавляння суспензії фарбою; 1000 — кількість кубічних міліметрів у 1 см 3 ; 0,9 — об’єм камери Горяева, мм3 .

3. Здебільшого при посіві у пробірки оптимальна посівна концентрація становить 200 — 500 тис. клітин, а для курячих фібробластів — 0,7 - 1 млн клітин на 1 мл. У зв’язку з цим розраховують, скільки живильного середовища потрібно добавити до суспензії клітин, щоб отримати відповідну концентрацію.

4. Наприклад, X- 8 млн/мл. Потрібно приготувати суспензію з концентрацією клітин 0,8 млн/мл. Обчислюємо: 8 : 0,8 = 10. Отже, до 1 мл вихідної суспензії клітин потрібно добавити 9 мл живильного середовища. Розбавлену в такий спосіб живильним середовищем суспензію клітин стерильною піпеткою з грушею розливають у стерильні пеніцилінові флакони чи пробірки з гумовими пробками по 1 мл. На флакон чи пробірку восковим олівцем наносять поздовжню риску, кладуть їх на планшет рискою догори під кутом нахилу 5°. Планшет вміщують у термостат при 37 °С.