Бут вирус лаб 7
.docxЛабораторна робота 7
Тема: приготування посуду, сольових та живильних середовищ для культивування культури клітин.
Мета: опанувати методики приготування посуду, сольових та живильних середовищ для культивування культури клітин.
Хід роботи:
Опанування методу первинного приготування посуду.
Все обладнання вірусологічної лабораторії розділяють на 5 груп:
1. Флакони, пробірки, колби для культивування, флакони для поживних середовищ, центрифужні пробірки.
2. Піпетки.
3. Шприци.
4. Фільтри.
5. Гумові предмети.
Обробка посуду кожної групи передбачає кип’ятіння в лужних розчинах, обробку кислотами і остаточну стерилізацію, яка включає автоклавування або стерилізацію сухим жаром. Деяка видозміна схем обробки може бути зв’язана з матеріалом, з якого виготовлене відповідне обладнання ( термостійкі або нетермостійкі пластики та гуми).
Методика обробок лабораторного посуду та обладнання:
Флакони, пробірки, колби - кип’ятити 15 хв. в синтетичному миючому засобі.
1. Обробити абразивом або ферментним препаратом (в разі потреби)
2. Промити 3 рази проточною водою
3. Витримати 2 години в 15-20% сірчаній кислоті.
4. Промити 10-15 разів проточною і 5 разів дистильованою водою.
5. Висушити при 100-110оС.
6. Закрити фольгою і стерилізувати в сушильній шафі при 170оС.
Піпетки - кип’ятити 15 хв. в синтетичному миючому засобі.
1. Промити теплою водою.
2. Витримати в 15-20% H2SO4 (2 год) або в 4% HCl (10- 12 год).
3. Промивати 1 годину проточною водою (в апараті для піпеток).
4. Витримати 2 години в дистильованій воді.
5. Висушити при 100-110оС.
6. Стерилізувати в сушильній шафі при 170оС.
Шприци - промити дистильованою водою.
1. Загорнути в марлю.
2. Покласти в чашку Петрі.
3. Стерилізувати в автоклаві при 120оС -10 хв.
Гумові предмети (корки, шланги) - кип’ятити 10-15 хв. в синтетичному миючому засобі.
1. Промити теплою водою.
2. Кип’ятити 10 хв. в 0,2% розчині соляної кислоти.
3. Витримати 1 годину в теплій воді.
4. Багаторазово промивати дистильованою водою.
Порожній лабораторний посуд після всіх обробок стерилізується сухим жаром у сушильній шафі. Режим роботи приладу – температура 165оС - півтори години або 180оС - 30 хв. – необхідно контролювати (внутрішній термометр або папірці для перевірки якості стерилізації).
Ознайомитися із середовищами та сольовими розчинами.
Сольові розчини.До складу збалансованих сольових розчинів входять катіони кальцію, калію та натрію в таких же пропорціях, як у крові вищих тварин — 0,25:0,42:9 г/л. Найбільш поширеними є розчини Ерла, Хенкса, Дульбекко. Ці розчини використовують для промивання клітин, як основу для розчину трипсину, а також для короткочасного зберігання клітин протягом декількох годин або діб.
Ростові середовища. Це збалансовані сольові розчини з внесеними до них поживними речовинами. Ці живильні середовища повинні забезпечувати необхідні для росту клітин фізико-хімічні умови та надавати поживні речовини для проліферації клітин та продукування цільового продукту. До складу ростових середовищ повинні входити: неорганічні іони (К + , Na + , Cl - , Ca 2+ , Mg 2+, HPO4 2- ), амінокислоти (аргінін, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, треонін, триптофан, тирозин, цистин, глутамін та валін), вітаміни (групи В, іноді С, Е та А), вуглеводи (найчастіше глюкоза), ліпіди, гормони та фактори росту. Найбільш поширені середовища: ТСМ-199, ДМЕМ, МЕМ, F12. Підтримувальні середовища використовують головним чином для підтримки клітинних культур у доброму стані протягом декількох тижнів. У порівнянні з ростовими середовищами вони містять менше поживних речовин. До всіх середовищ додають антибіотики у невеликих концентраціях, бо свіжоізольовані клітини практично завжди схильні до мікробної контамінації. Більшість клітин здатні до проліферації тільки в середовищах з різними природними добавками, зазвичай сироваткою. Тому середовища для культивування клітин тварин ще поділяють на ті, що містять сироватку або не містять. Для збагачення поживних середовищ, як правило, використовують фетальну сироватку теляти. Сироватка зазвичай входить до складу ростових середовищ у концентрації 5–10%. Вона виконує багато функцій (інгібітор протеаз та токсинів, постачальник незамінних низькомолекулярних поживних речовин, факторів адгезії та ін.), але й має недоліки (варіабельність складу, можлива контамінація вірусами, мікоплазмами, бактеріями, неможливість точного визначення поживності середовища, а також ускладнює очищення кінцевого продукту). У безсироваткові середовища найчастіше додають бичачий сироватковий альбумін (ВSA). Всі середовища за своїм призначенням діляться на ростові і підтримують. У складі ростових середовищ повинно міститися більше поживних речовин, щоб забезпечити активне розмноження клітин для формування моношару на поверхні скла або достатньо високу концентрацію клітинних елементів в суспензії (при отриманні суспензійних культур). Підтримуючі середовища фактично повинні забезпечувати лише переживання клітин у вже сформованому монослое при розмноженні в клітинах вірусних агентів. Ростові і підтримують середовища багатокомпонентні. До їх складу можуть входити як природні продукти (амніотичні рідини, сироватки тварин), так і субстрати, отримані в результаті часткової обробки природних продуктів (ембріональні екстракти, гідролізат лактальбуміну, гемогідролізат, аминопептид і т. д.), а також синтетичні хімічно чисті речовини (амінокислоти, вітаміни, солі). Всі природні продукти малостандартни, їх використання пов'язане з великою небезпекою мікробної та вірусної контамінації клітинних культур. У зв'язку з цим і відбувається поступове витіснення їх синтетичними стандартними сумішами. Найбільше застосування знаходять синтетична середу 199 і середу Голка. Широко використовуються середовища, що містять строго певні кількості солей, амінокислот і вітамінів. Незалежно від призначення всі поживні середовища для тканинних культур конструюються на основі якого-небудь збалансованого сольового розчину з достатньою буферною ємністю. Найчастіше ними є розчини Хенкса і Ерла. Ці розчини - обов'язковий компонент будь-якої живильного середовища. Невід'ємним компонентом більшості ростових середовищ є сироватка тварин (теляча, бичача, кінська), без наявності 5-10% якої розмноження клітин і формування моношару не відбувається. Включення сироватки в той же час перешкоджає створенню ростових середовищ точного хімічного складу, дуже важливих для розвитку фундаментальних досліджень з клітинної фізіології, так як разом з сироваткою (або її дериватами) вводиться цілий комплекс неконтрольованих факторів, що варіюють залежно від серії сироватки. У 50-ті роки Ewans і Waymouth були запропоновані бессивороточние середовища точного хімічного складу. Однак ці середовища не забезпечували тих показників проліферативної активності клітин, які зумовлюють середовища з додаванням сироваток. У зв'язку з цим становить інтерес робота Birch і Pirt, що показали, що для забезпечення інтенсивного росту клітин у бессивороточних середовищах визначальним є включення сірчанокислих солей Fe, Zn, Cu, а також МnС12. У ростові живильні середовища, а так само в буферний розчин для промивання тканин додають антибіотики. Їх вводять в середу безпосередньо перед вживанням з розрахунку 1 мл основного розчину антибіотиків на 500 мл середовища.