Бут вирус лаб 5

Лабораторна робота 5

Тема: люмінесцентна мікроскопія.

Мета: засвоїти методику проведення реакції імунофлуоресцієнції у лабораторній діагностиці.

Хід роботи:

1. Засвоєння теоретичних засад явища люмінесценції.

Суть методу полягає у здатності деяких речовин під дією короткохвильових променів синьо-фіолетового (380-485 нм) або ультрафіолетового світла (до 360 нм) випромінювати світло у іншому хвильовому діапазоні. При цьому довжина хвилі світла, що випромінює об’єкт, буде завжди більше за довжину хвилі світла, яке збуджує таку люмінесценцію. Наприклад, якщо опромінювати об’єкт синім світлом (440- 485 нм), він буде випромінювати зеленим (500-565 нм), жовтим (565-590 нм), оранжевим (590-625 нм) та червоним світлом (625-740 нм). Усім живим клітинам властива флуоресценція, яка має назву власної, або первинної. Вона є слабкою і тому частіше використовують так звану вторинну флуоресценцію, коли об'єкти попередньо обробляють спеціальними люмінесцентними барвниками - флуорохромами (акридиновий 12 оранжевий, корифосфін О, тіазиновий червоний, ізотіоцианат флуоресцина та інш.). Промені світла від сильного джерела (зазвичай, меркурієвої лампи надвисокого тиску) пропускають через синьо-фіолетовий світлофільтр. Під дією цього короткохвильового випромінювання фарбовані флуорохромом клітини починають випромінювати червоне або зелене світло. Для того, щоб синє світло, яке викликає люмінесценцію, не заважало дослідженню, над окуляром виставляють блокуючий жовтий світлофільтр, який затримує сині, але пропускає жовті, червоні та зелені промені. Як наслідок, при спостереженні у люмінесцентному мікроскопі на темному фоні будуть спостерігатися клітини, що світяться жовтим, зеленим або червоним кольором. Наприклад, при фарбуванні акридиновим оранжевим ДНК ядра клітини буде світитися яскраво-зеленим кольором

2. Підготовка мазків для імунофлюоресценції.

При прямому методі до досліджуваної суспензії мікробів, фіксованій на склі, додають сиворотку , мічену флуорохромом. Утворений комплекс антиген-антитіло при освітленні ультрафіолетовими (синьо-фіолетовими) променями дає яскраво-зелене свічення.

Непрямий метод РІФ полягає у виявленні комплексу антиген - антитіло за допомогою антиглобулінової (проти антитіла) сиворотки, міченої флюорохромом. Для цього мазки з суспензії мікробів обробляють антитілами антимікробної кролячої діагностичної сиворотки. Потім антитіла, які не зв'язалися з антигенами бактерій, відмивають, а ті що залишилися на мікробі виявляють, обробляючи мазок антиглобуліновою (антикролячою) сивороткою, міченою флюорохромами. В результаті утворюється комплекс мікроб + антимікробні кролячі антитіла + антикролячі антитіла, мічені флюорохромом. Цей комплекс спостерігають в люмінесцентному мікроскопі, як і при прямому методі.

Непрямий метод РІФ у діагностиці вірусів. Культуру клітин, яка розташовується моношаром на предметних скельцях, попередньо заражають досліджуваним матеріалом, що містить віруси, та інкубують при оптимальних параметрах протягом декількох днів. Після цього скельця фіксують в ацетоні та наносять на них специфічну сиворотку. Систему інкубують у вологій камері при температурі 37 °С протягом 30 хв, відмивають від надлишку сиворотки і наносять тонкий шар флуоресціюючої антисироватки. Після 30 хвилинного контакту скельця відмивають для видалення надлишку антитіл, підсушують і досліджують під люмінісцентним мікроскопом, спостерігаючи характерне свічення.

3. Діагностичне значення РІФ.

Застосовується для експрес-діагностики інфекційних захворювань (ідентифікація збудника в досліджуваному матеріалі), а також для визначення АТ і поверхневих рецепторів і маркерів лейкоцитів (иммунофенотипирование) і ін. клітин.