Бут вирус лаб 2

Лабораторна робота 2

Тема: відбір, транспортування та підготовка патологічного матеріалу від хворих та загиблих тварин для вірусологічних досліджень.

Мета: ознайомитись з  правилами відбору, транспортування та підготовки патологічного матеріалу для вірусологічних досліджень.

Хід роботи:

1. Ознайомитись з правилами відбору патологічного матеріалу.

Внутрішні органи. Розтин трупів тварин виконують за загальноприйнятою методикою. Для вірусологічних досліджень найчастіше беруть легені, печінку, селезінку, нирки, лімфовузли, слизові оболонки носа, рота, трахеї, бронхів, передшлунків, тонкої кишки, шматочки новоутворень. У разі наявності макроскопічних змін органів з ураженої ділянки вирізають шматочки масою 10 - 20 г, захоплюючи також неушкоджену тканину.

Головний мозок. У тварин після дезінфекції та видалення волосяного покриву, шкіри й м’язів розпилюють черепну коробку, знімають тверду мозкову оболонку. Оголений головний мозок виймають повністю і вміщують у стерильний посуд.

Спинний мозок. Розсікають уздовж хребта м’язи спини, спеціальними кістковими щипцями пересікають з обох боків остисті відростки хребців, знімають тверду мозкову оболонку. Оголений спинний мозок виймають повністю або фрагментами разом з корінцями і вміщують у стерильну чашку Петрі.

2. Ознайомитись з основними правилами транспортування патологічного матеріалу.

На пробірки й флакони наклеюють етикетки з лейкопластиру, де пишуть простим олівцем, який саме матеріал і від якої тварини отримано. Пробірки і флакони з пробами вміщують у металеві контейнери. Вільний простір заповнюють ватою або зім’ятим папером для амортизації ударів і адсорбції рідини у разі, якщо скло трісне чи розіб’ється. Контейнер кладуть у термос, обкладають охолоджувальною сумішшю. На термос із пробами патологічного матеріалу прикріплюють бирку з картону чи фанери, на якій зазначають господарство, вид тварини, вид матеріалу й дату. Термос має бути опечатаний. На матеріал, який надсилають у лабораторію, пишуть супровідну, в якій вказують повну інформацію про тварину, від якої взято проби, вид матеріалу, епізоотологічні дані, попередній діагноз, прізвище спеціаліста і дату. Цими даними керуються при виборі напряму лабораторних досліджень. Доставлені в лабораторію проби потрібно негайно дослідити. Якщо з якихось причин (наприклад, через відсутність культури клітин) дослідження відкладається, матеріал потрібно зберігати за температури —20...—70 °С.

3. Ознайомитись з основними правилами підготовки патологічного матеріалу для вірусологічних досліджень

У лабораторії отриманий патологічний матеріал звільняють від консерванту (розморожують, відмивають від гліцерину). Частину матеріалу використовують для вірусологічних досліджень, другу — зберігають у холодильнику на випадок додаткових досліджень. Підготовка органів і тканин (отримання 10%-ї вірусовмісної суспензії):

1. Тканину ретельно подрібнюють ножицями і розтирають у ступці зі стерильним кварцовим піском.

2. Додають ФБР або розчин Хенкса з розрахунку 1 : 10.

3. Розливають у центрифужні пробірки і центрифугують при 2 - З тис. об/хв упродовж 15 - ЗО хв.

4. Надосадову рідину (вірусовмісну суспензію) відсмоктують у стерильні флакони.

5. Для звільнення від супутньої мікрофлори суспензію обробляють антибіотиками широкого спектра дії: пеніциліном — 100 - 1000 ОД/мл і стрептоміцином — 100 - 1000 мкг/мл (дози залежать від виду тканини). Витримують упродовж 30-60 хв за кімнатної температури.

6. Ставлять бактеріологічний контроль: роблять посіви на МПА, МПБ, МППБ і середовище Сабуро.

7. Після отримання негативного результату бактеріологічного контролю вірусовмісний матеріал використовують для зараження лабораторних об’єктів (лабораторних тварин, курячих ембріонів або культур клітин). У разі позитивного результату бактеріологічного контролю вірусовмісну суспензію повторно обробляють антибіотиками і знову перевіряють на стерильність. Суспензію зберігають за температури -20...-70 °С. Іноді вірусовмісну суспензію звільняють від мікрофлори за допомогою бактерійних фільтрів. Слід мати на увазі, що при цьому частина вірусу може адсорбуватись на фільтрі. Підготовка секретів і змивів. Секрети і змиви центрифугують при 2-3 тис. об/хв упродовж 20 хв. Надосадову рідину відсмоктують у стерильні пробірки, обробляють пеніциліном — 500 — 1000 ОД/мл і стрептоміцином — 500 — 1000 мкг/мл і після бактеріологічного контролю використовують для зараження лабораторнихоб’єктів. З осаду готують мазки для РІФ. Аналогічно готують змиви, отримані за допомогою ватних тампонів, занурених у фізрозчин або розчин Хенкса. Тампони струшують упродовж 10 - 15 хв, ретельно витискають, отриману рідину центрифугують, обробляють антибіотиками, ставлять бактеріологічний контроль. Підготовка фекалій. У банку зі скляними кульками вносять 10 мл розчину Хенкса або ФБР і 1 г фекалій. Струшують до утворення гомогенної суміші, центрифугують при 2-3 тис. об/хв упродовж ЗО хв. Надосадову рідину відсмоктують, обробляють пеніциліном (500 - 1000 ОД/мл), стрептоміцином (500 — 1000 мкг/мл) і ністатином (ЗО - 40 ОД/мл), ставлять бактеріологічний контроль. Матеріал зберігають при —10...-20 °С. В день зараження лабораторних об’єктів його розморожують і повторно центрифугують. Підготовка сечі. Сечу за потреби прояснюють центрифугуванням при 2-3 тис. об/хв упродовж 20 хв, обробляють пеніциліном (500 — 1000 ОД/мл) і стрептоміцином (500 — 1000 мкг/мл), ставлять бактеріологічний контроль. Підготовка вмісту везикул і пустул. Рідину, розбавлену середовищем для культури клітин 1:5, за потреби прояснюють центрифугуванням при 2-3 тис. об/хв впродовж 20 хв, обробляють пеніциліном (200 — 500 ОД/мл) і стрептоміцином (200 - 500 мкг/мл), ставлять бактеріологічний контроль. Нативну везикулярну і пусту- льозну рідину спочатку розбавляють фізрозчином або розчином Хенкса 1 : 5, потім центрифугують, обробляють антибіотиками, ставлять бактеріологічний контроль. Підготовка уражень шкіри і слизових оболонок. Стінки везикул і пустул, кірки та луски шкіри розтирають у ступці зі стерильним кварцовим піском і розбавляють фізрозчином або розчином Хенкса 1 : 5 - 1 : 10. Центрифугують при 2 — 3 тис. об/хв впродовж 15 хв, обробляють пеніциліном (200 — 500 ОД/мл) і стрептоміцином (200 - 500 мкг/мл), ставлять бактеріологічний контроль. Підготовка крові. Кров (дефібриновану, «лакову» або з антикоагулянтом) заморожують. Після відтавання гемолізовану кров центрифугують при 2-3 тис. об/хв впродовж 15 хв, обробляють пеніциліном (100 - 200 ОД/мл) та стрептоміцином (100 - 200 мкг/мл) і після проведення бактеріологічного контролю використовують для зараження лабораторних об’єктів. Для виділення вірусу придатна також кров, що згорнулася, її розтирають у ступці, добавляють розчин Хенкса 1 : 1 або 1 : 2, центрифугують, обробляють антибіотиками, ставлять бактеріологічний контроль. Отримання сироватки крові. Для серологічних досліджень кров беруть двічі у одних і тих самих тварин: на початку хвороби і наприкінці з інтервалом 2-3 тижні (для отримання парних сироваток). Кров в об’ємі 10 — 15 мл беруть у стерильні пробірки з гумовими пробками, витримують упродовж 1 год при 37 °С. Утворений згусток обводять скляною паличкою або пастерівською піпеткою і ставлять на 18 — 20 год у холодильник при 4 °С (для прискорення ретракції кров’яного згустку і збільшення виходу сироватки). Сироватку відсмоктують піпеткою, за потреби центрифугують при 1500 об/хв впродовж 10 хв для видалення домішок еритроцитів, обробляють пеніциліном (100 - 200 ОД/мл) і стрептоміцином (100 - 200 мкг/мл), ставлять бактеріологічний контроль. Зберігають сироватки в холодильнику при 4 °С або в замороженому стані при -10...-20 °С.