4. Серологічні методи діагностики в інфекційних захворюваннях, типии реакцій

Серологічні реакції базуються на зв'язуванні компонентів реакції антиген-антитіло.

1. Реакція нейтралізації (РН) базується на здатності імунної сироватки при додаванні до відповідного вірусу блокувати його здатність до репродукції. В серологічній діагностиці РН застосовується для виявлення наростання титру нейтралізуючих антитіл до певного (відомого) вірусу в парних сироватках крові. Титр імунної сироватки − кінцеве її розведення, яке ще забезпечує оптимальну взаємодію з антигеном. Титр залежить від концентрації в імунній сироватці антитіл певної специфічності.

2. Реакція гемагглютинації (РГА).

Гемагглютинація − це феномен склеювання еритроцитів внаслідок дії на них різних мікроорганізмів.

Механізм гемагглютинації полягає в склеюванні еритроцитів( тварин або людини), на поверхні яких адсорбувалися мікроорганізми; останні являються містками, які з'єднують сусідні еритроцити. Як правило, мікроорганізми, що становлять одну таксономічну групу, аглютинують еритроцити одних і тих же видів тварин. Видова належність аглютинованих еритроцитів нерідко використовується для індикації мікрооганізмів.

3. Реакція гальмування гемагглютинації (РГГА).

Гемагглютинація- зворотній процес. Про специфічність мікробної гемагглютинації роблять висновок по ефекту гальмування або придушення її відповідними антимікробними антитілами. Це явище лежить в основі РГГА. Механізм РГГА полягає в тому, що протимікробні антигемагглютиніни перешкоджають мікроорганізмам аглютинувати еритроцити чутливих видів тварин.

Залежно від мети постановки РГГА її результатом є або ідентифікація ізольованого штаму, гемаагглютинацію якого подавила відома сироватка, або виявлення специфічних протимікробних антитіл в досліджуваній сироватці крові.

4.Реакція зв'язування комплементу (РЗК) - це складна реакція, яка протікає в дві фази. Для її постановки необхідні наступні інгредієнти: антиген, антитіло, комплемент, еритроцити барана, гемолітична імунна сироватка.

У РЗК беруть участь дві системи антиген- антитіло: специфічна і гемолітична. Специфічна система є:

а) відомий антиген (діагностикум) і сироватку крові хворого або реконвалісцента (що містить відповідні цьому антигену антитіла);

б) або невідомий антиген і відому діагностичну імунну сироватку крові реконвалісцента. Якщо антиген і антитіло гомологічні, вони утворюють специфічний невидимий комплекс, який сорбує на собі комплемент.

Адсорбція комплементу на специфічному комплексі може бути виявлена лише за допомогою гемолітичної системи, складається з антигена (еритроцити барана) і імунної сироватки (антисироватки до нього). Гемоліз еритроцитів в гемолітичній системі наступає лише у присутності вільного комплементу. У разі утворення специфічного комплексу він адсорбує коплемент. Якщо антиген і антитіло гетерологічні, комплемент знаходитися у вільному вигляді, оскільки окремо ні антигеном, ні антитілом він не сорбується. При додаванні гемолітичної системи відбувається гемоліз еритроцитів (негативний результат).

РЗК може бути використана для виявлення вірусних анитигенів в заразливому матеріалі, а також для виявлення антитіл в сироватці крові хворих.

5. Реакція пассивної гемагглютинації (РПГА) або непрямої гемагглютинації (РНГА) використовується в діагностиці кору, захворювань, що викликаються вірусами групи Коксакі В, кліщового енцефаліту, сказу, гепатиту В, аденовірусами і ін.

Принцип реакції полягає в тому, що еритроцити (частіше всього людини або барана), сенсибілізовані антигеном (або антитілом) в присутності гомологічного антитіла (або антигену) склеюються, тобто дають феномен пасивної гемагглютинації.

Імунохроматографічний аналіз (ІХА) - це метод визначення наявності певних концентрацій речовин у біологічних матеріалах (сеча, цільна кров, сироватка або плазма крові, слина, кал і т.д.) та заснований на реакції між антигеном і відповідним йому антитілом. Даний вид аналізу здійснюється за допомогою індикаторних смужок, паличок, панелей або тест-касет, які забезпечують швидкість проведення тестування. позначається в літературі також як метод сухої імунохімії, стрип-тест, QuikStrip cassette або експрес-аналіз.

Принцип дії імунохроматографічного тесту полягає в тому, що при зануренні тесту в фізіологічну рідину вона починає мігрувати вздовж смужки за принципом тонкошарової хроматографії. Рухомою фазою в даному випадку є фізіологічна рідина. Разом з рідиною рухаються і антитіла з барвником. Якщо в цій рідині присутній досліджуваний антиген (гормон, інфекційний або онкологічний маркер), то відбувається його зв'язування. При цьому відбувається накопичення антитіл з барвником навколо антитіл, жорстко іммобілізованих в тест-зоні ІХА-смужки, що проявляється у вигляді яскравої темної смуги. Незв'язані антитіла з барвником мігрують далі вздовж смужки і неминуче взаємодіють із вторинними антитілами в контрольній зоні, де і утворюється друга темна смуга. Взаємодія (темна смуга) в контрольній зоні повинна виявлятися завжди, незалежно від присутності досліджуваного антигену в фізіологічній рідини. Результати визначаються візуально або комп'ютерною обробкою відсканованого зображення.

Принцип РІФ базується на виявленні флюорисцуючих антитіл. Адсорбований антиген з’єднують з імунною сироваткою, після чого утворений комплекс антиген-антитіло обробляють γ-глобуліном, з’єднаним із флюорисцин-ізотіоціанатом. Так як мічені флюорохромом антитіла не втрачають властивості з’єднуватись з антигеном та тим самим обумовлюють світіння препаратів в синьо-фіолетових променях, джерелом яких є ртутно-кварцева лампа. Матеріалами для проведення дослідження можуть бути змиви з носоглотки, кров, спинномозкова рідина та інші біологічні рідини, де може знаходитись збудник.

Імуноферментний аналіз (ІФА) або, точніше, ферментний імуносорбентний аналіз — імунологічний метод для визначення наявності певних антигенів, що заснований на ідентифікації комплексів антиген-антитіло.

Існує цілий ряд підходів, що дозволяють визначити, чи відбулося зв’язування антитіла з антигеном-мішенню. Один з них — це ферментний іммуносорбентний аналіз (ELISA), що часто використовується для діагностики різноманітних антигенів.

Ферментний імуносорбентний аналіз широко застосовується для діагностики різноманітних інфекційних захворювань, ракових процесів (восновному завдяки специфічним білкам і пептидам), визначення різноманітних низькомолекулярних сполук, таких як токсини, лікарські засоби і т. п.

Механічні інгібітори антивірусної дії

Крім антитіл — специфічного фактора противірусного імунітету — організм виробляє особливі вірусотропні речовини — інгібітори, здатні взаємодіяти з вірусами і придушувати їх активність. Інгібітори до вірусів грипу в нормальних сироватках людини і тварин уперше знайшов у 1942 р. Херст. Сироваткові інгібітори мають широкий діапазон дії: одні придушують гемаглютинуючі властивості вірусів, інші — їх цитопатогенну дія, треті — їх інфекційну активність.

Термолабільні β- чи Chu-інгібітори містяться в нормальних сироватках людини і тварин (морських свинок, курей, овець, коней, корів, свиней, і ін.). Вони мають широкий діапазон віруснейтралізуючої дії, здатні блокувати гемаглютинуючу активність вірусів грипу, ньюкаслской хвороби, кору і нейтралізувати інфекційні й імуногенні властивості, інгібіторочутливих вірусів.

Термостабільні γ-інгібітори високоактивні проти сучасних варіантів вірусу гриппу

Термостабільні α-інгібітори блокують гемаглютинуючу, але не інфекційну активність вірусу. Для оцінки активності α-інгібіторів (наприклад, інгібітора Френсіса) випробувані сироватки досліджують з індикаторним вірусом, позбавленим ензиматичної активності після прогрівання при 560С протягом 30 хвилин. Критерієм поділу сироваткових інгібіторів на термостабільну і термолабільну групи є їх стійкість до прогрівання при 56 °С протягом 30 хвилин.

Установлено глибокі відмінності біохімічної природи інгібіторів і їх кількісний вміст у сироватках різного виду тварин. Між інгібіторами й антитілами є різниця у взаємодії їх з вірусом грипу: на відміну від антитіл комплекс інгібітор — вірус не фіксує комплемент, і друга - вірусні гемаглютиніни, нейтралізовані інгібіторами, не втрачають здатності до наступної реакції зі специфічними противірусними антитілами. Виявилося, що такий блокований інгібіторами вірус може вилучати із сироватки специфічні антитіла в такому ж ступені, як і вірус нативний. Однак вірус, блокований антитілами, не здатний вилучати інгібітори з нормальної кролячої сироватки.

Якщо в сироватці одночасно присутні антитіла й інгібітори, то з вірусом з'єднуються насамперед антитіла, а інгібітори при деякому надлишку антитіл з вірусом не взаємодіють. Вірусні частки здатні звільнятися від блокуючої дії інгібіторів, і відновлювати знову свою гемаглютинаційну активність. Навпаки, специфічні антитіла утворюють з вірусом більш міцний зв'язок, не дають дисоціації, і вірус не відновлює блокованих гемаглютинінів. Для звільнення сироваток від інгібіторів існує ряд методів: обробка вуглекислим газом, фільтратом холерного вібріона, ацетоном, перйодатом калію чи натрію, риванолом.

Неспецифічні інгібітори секретів верхніх дихальних шляхів. Крім сироваткових інгібіторів описані інгібітори тканин, секретів і екскретів тварин, у тому числі птахів. Такі інгібітори виявилися активними у відношенні багатьох вірусів і насамперед вірусів грипу й епідемічного паротиту. Слизисті оболонки дихальних шляхів — вхідні ворота для багатьох вірусів, частина яких розмножується в цьому регіоні. Потрапляючи на поверхню носоглотки чи трахеї, респіраторні віруси занурюються в слизистий секрет, наділений противірусною активністю. Секреторні інгібітори подібні із сироватковими α-інгібіторами Френсіса. Активний вірус відщеплює сіалову кислоту від молекули інгібітору, що веде до руйнування його антигемаглютинуючої активності

Ретроспективна діагностика хвороб

У діагностиці вірусних хвороб ретроспективна діагностика відіграє дуже важливу роль.

Існують обставини, за яких практично неможливо виділити вірус, або коли вірус належить до важкоізолюючих з патологічного матеріалу. При проведенні ретроспективної діагностики застосовують серологічні методи. Для цієї мети досліджують парні сироватки крові хворих тварин, для отримання яких від кожної тварини кров для дослідження на наявність специфічних антитіл беруть двічі з інтервалом в 2-3 тижні: на початку захворювання (в гострій фазі) і в кінці його (в період одужання). Щоб сироватки були стерильними, беруть кров і отримують з неї сироватку в асептичних умовах. До дослідження сироватки в пробірках під пробками зберігають у холодильнику або в замороженому стані. Парні сироватки крові зазвичай беруть не менше ніж від 10-20 тварин і досліджують їх одночасно.

Завдання дослідження зводиться до встановлення в парних сироватках титру антитіл до вірусів, які імовірно могли б бути збудниками хвороб тварин, від яких отримані сироватки. Припущення, до яких вірусам слід шукати антитіла, виходить з попереднього діагнозу, поставленого за даними епізоотологічних спостережень, клінічних симптомів і патологоанатомічних змін. Наявність у сироватках антитіл та їх титри визначають в серологічних реакціях з використанням еталонних антигенів передбачуваних вірусів. Після встановлення титру антитіл у парних сироватках результати інтерпретують виходячи з динаміки титру антитіл. Вважається, що наростання в 4 рази і більше титру антитіл у другій сироватці в порівнянні з першою впевнено свідчить про активне інфекційному процесі, що протікає в організмі тварини в період взяття у нього крові. При цьому хвороба була викликана тим збудником, до якого було встановлено підвищення титру антитіл у парних сироватках.

Недолік методу в його ретроспективності, так як до моменту постановки діагнозу тварина, від якої отримано парні сироватки, уже або видужало, або злягло. Проте поставлений серологічними методами діагноз достовірний, він дає впевнені уявлення про хворобу і має важливе значення для заходів щодо ліквідації вірусної хвороби

1.засоби специфічної профілактики хвороб тварин

Специфічна профілактика – це спеціальна система заходів, спрямованих на запобігання появі певної (конкретної) інфекційної хвороби. Характер специфічних профілактичних заходів визначається особливостями інфекційного захворювання та епізоотичною ситуацією господарства і навколишньої території.

До специфічної профілактики належать:

-  проведення спеціальних діагностичних досліджень (туберкулінізація, малеїнізація, серологічна діагностика на бруцельоз та ін.).

-  превентивну ізоляцію, вимушене карантинування і спостереження з метою уточнення діагнозу;

-  здійснення лікувально-профілактичних заходів спеціального призначення (премікси й аерозолі при профілактиці аліментарних і респіраторних інфекцій);

-  імунопрофілактика шляхом застосування різних специфічних засобів – вакцин, сироваток, імуноглобулінів та ін.

Її проводять відповідно до планів протиепізоотичної роботи в благополучних господарствах, поголів'я яких необхідно захистити від конкретної інфекційної хвороби.

Ветеринарні біопрепарати (від грец. bios – життя і лат. pгаерагаtus – препарат, виготовлений) – засоби, які використовують для діагностики, лікування та профілактики інфекційних хвороб чи для підвищення продуктивності тварин.

Зусиллями багатьох видатних вчених (Бернет Ф., Гельман Х., Дженер Е., Кох Р., Мечников І., Медавар П., Пастер Л. та ін.) створені теоретичні і практичні передумови виробництва та використання біопрепаратів – специфічних засобів впливу на організм людини і тварини (чи визначення їх стану), особливо при інфекційних захворюваннях.

Біопрепарати виготовляють із мікроорганізмів, продуктів їх життєдіяльності, чи із органів і тканин тварин. Кількість біопрепаратів постійно зростає, тому фахівцю потрібно добре знати походження кожного препарату і механізм його дії на організм, щоб не ускладнити перебіг інфекційного процесу, не порушити реактивності організму.

Головною спрямованою дією біопрепаратів на організм є вплив на імунну систему. Використовуючи біологічні засоби, ми або корегуємо реактивність організму відповідно до інфекційного агента або визначаємо його стан на даній стадії епізоотичного процесу.

Вакцини (Vaccines) - препарати, призначені для створення активного імунітету в організмі щеплених людей чи тварин. Основним діючим початком кожної вакцини є іммуноген, тобто корпускулярна чи розчинена субстанція, що несе на собі хімічні структури, аналогічні компонентам збудника захворювання, відповідальним за вироблення імунітету.

У залежності від природи іммуногена вакцини підрозділяються на:

1. цільномікробні чи цільновіріонні, що складаються з мікроорганізмів, відповідно бактерій чи вірусів, які зберігають у процесі виготовлення свою цілісність;

2. хімічні вакцини з продуктів життєдіяльності мікроорганізму (класичний приклад - анатоксини) чи його інтегральних компонентів, т.зв. субмікробні чи субвіріонні вакцини;

3. генно-інженерні вакцини, що містять продукти експресії окремих генів мікроорганізму, напрацьовані в спеціальних клітинних системах;

4. химерні, чи векторні вакцини, у яких ген, що контролює синтез протективного білка, убудований у нешкідливий мікроорганізм у розрахунку на те, що синтез цього білка буде відбуватися в організмі щепленого і, нарешті,

5. синтетичні вакцини, де в якості іммуногена використовується хімічний аналог протективного білка, отриманий методом прямого хімічного синтезу.