1. Родина Poxviridae. Збудник міксоматозу кролів.

Класифікація: Підродина Chordopoxvirinae. Рід Orthopoxvirus – вірус віспи корів, вірус віспи вакцини, вірус виспи мишей. Рід Parapoxvirus – вірус контагіозного пустульозного дерматиту оцець і кіз, псевдо віспи корів. Рід Carapoxvirus – вірус віспи овець. Рід Suipoxvirus – віспи свиней. Рід Avipoxvirus – віспи курей. Рід Molluscipoxvirus – контагіозного молюска.Рід Leporivirus – вірус міксоми кролів(міксоматозу кролів). Рід Yatapoxvirus – вірус пухлин мавп. Основні ознаки родини: віріони мають форму цеглини із заокругленими кутами, розміри 170-300,450 нм. (Парапоксвірус –овоїдної форми). Відноситься до ДНК-вмісних вірусів. Віріон складається із зовнішньої оболонки з трубчастими ворсинками, яка має ліпопротеїнову природу і синтезується в цитоплазмі заражених клітин. Зовнішня оболонка оточує серцевину (нуклеоїд) у вигляді вісімки. По боках у випинанням розміщенні овальні структури – бічні тіла, функція яких невідома. У серцевині – 2 ланцюгова молекула ДНК, що асоційована з 3 білками. Поксвіруси містять до 33 стуктурних білки, 15 ферментів. Реплікація та складання віріонів відбувається в цитоплазмі, зрілі вібріони доставляються до плазмолеми через комплекс Гольджі і виходять із клітини шляхом екзоцитозу або після лізису. Репродукція – 6-7 годин.. У зовнішньому середовищі вірус у віспяних кірочках зберігається від кількох місяців до 1,5 – 2 років. За температури 70 °С він інактивується впродовж 5 хв, а при кип’ятінні — за 2 – 3 хв; ультрафіолетове випромінювання інактивує вірус за 4 год, 3 – 5%-ві розчини хлораміну й фенолу — за 1 – 2 год. Збудник міксоматозу кролів. Міксоматоз кролів (Myxomatosis cuniculorum) — гостра висококонтагіозна хвороба, що характеризується серозно-гнійним кон’юнктивітом і ринітом, утворенням пухлинних вузлів на шкірі, набряково-драглистою інфільтрацією підшкірної клітковини в ділянці голови, лап, хребта, зовнішніх статевих органів і ануса. Супроводжується надзвичайно високою летальністю. Збудник хвороби — ДНК-геномний вірус з родини Poxviridae, за структурою ідентичний вірусу фіброми та іншим віспяним вірусам.РідLeporivirus. Має цеглиноподібну форму із заокругленими кінцями, розмір 230 -290 нм, вкритий поверхневою білковою оболонкою. Вірус міксоматозу культивується на хоріоналантоїсній оболонці курячого або качиного ембріона, утворюючи характерні віспяні фокуси, а також у клітинній культурі курячих фібробластів та нирок кролів, морських свинок і людини, спричинюючи цитопатогенні зміни, утворення бляшок і великих цитоплазматичних включень. Вірус міксоматозу чутливий до дії ефіру, лугів, формальдегіду, фенолу, борної кислоти, перманганату калію. Стійкий у зовнішньому середовищі і зберігає вірулентність у висушеному патологічному матеріалі кролів упродовж 20 діб, Залишається життєздатним у трупах кролів 7 діб, у землі — до 10 тижнів, у сухих шкурках кролів при 15 – 20 °С — до 10 міс.

2. Іфа. Застосування в лабораторній практиці.

Суть ІФА – з відомим позитивним антигеном, що адсорбований на жорсткому носію взаємодіють антитіла досліджувальної сироватки крові. Комплекс антиген-антитіло, що утворюється у цьому разі, виявляють додатковим внесенням в лунки імунної сироватки, що містить мічені пероксидазою антитіла проби глобулінів того виду тварин, від якого взята сироватка. Одночасно додають відповідний субстрат для пероксидази.( виникає кольорова реакція різної інтенсивності, яку оцінюють візуально або за допомогою спектрометра).Він широко застосовується для діагностики різноманітних інфекційних захворювань, ракових процесів (в основному завдяки специфічним білкам і пептидам), визначення концентрації різноманітних низькомолекулярних сполук, таких як токсини, лікарські засоби тощо. П е р е в а г и ІФА полягають у високій чутливості та специфічності, доступності, швидкості та відносній простоті виконання. Метод можна використовувати в експрес-діагностиці для виявлення вірусу в патологічному матеріалі; твердофазний варіант придатний для ідентифікації вірусу й підтвердження його етіологічної ролі в ретроспективній діагностиці. ІФА ведеться безпосередньо в лунках мікропанелей зі швидкістю майже 100 аналізів за 1 хв і в лабораторних, і в польових умовах. До н е д о л і к і в ІФА можна віднести високу вартість сучасної складної апаратури

Методика постановки:

Для ідентифікації вірусу застосовують два варіанти ІФА: гістохімічний і твердофазний. Гістохімічний варіант ІФА (цитохімічний ІФА, імунопероксидазний тест) аналогічний РІФ із тією відмінністю, що для проведення реакції використовують антитіла, мічені не флуорохромом, а ферментом, результати враховують, розглядаючи препарати не під люмінесцентним мікроскопом, а під світловим. В імуноферментних кон’югатах з антитілами можуть використовуватися ферменти: пероксидаза, лужна фосфатаза,а також галактозидаза. Невисока молекулярна маса пероксидази сприяє кращому проникненню її крізь клітинну мембрану.Матеріалом для виявлення вірусу або його антигенів за допомогою ІФА можуть бути: мазки-відбитки чи гістозрізи різних органів загиблих і хворих тварин, покривні скельця з інфікованою вірусом культурою клітин, а також мазки крові.

Твердофазний імуноферментний аналіз. Методи твердофазного ІФА ґрунтуються на застосуванні антитіл і антигенів, фіксованих на нерозчинних носіях. Твердофазними носіями можуть бути мікропанелі, плівки із синтетичних полімерів з високою сорбційною здатністю — полістиролу, поліакриламіду, гранули із сефарози, целюлози, а також нітроцелюлозні мембрани (фільтри). Твердофазний ІФА успішно використовують для виявлення як вірусспецифічного антигену, так і специфічних антитіл у тварин- реконвалесцентів та імунізованих противірусними вакцинами.

1) у лунки мікропанелей автоматичними піпетками вносять по 0,2 мл - глобуліну потрібної концентрації у натрій-карбонатному буфері (рН = 9,6); 2) мікропанелі інкубують упродовж 1 год (37 °С) і залишають на ніч (4 °С); 3) вранці мікропанелі промивають тричі по 5 хв калій-фосфатним буфером (рН = 7,4), що містить 0,05 % твіну-20; 4) у лунки вносять по 0,2 мл розчину досліджуваного антигену та інкубують упродовж 2 год (37 °С); у контрольні лунки вносять наперед відомі позитивний і негативний антигени; 5) мікропанелі промивають (див. п. 3); 6) у лунки вносять по 0,2 мл імуноферментного кон’югату й інкубують упродовж 1 – 2 год (37 °С); 7) мікропанелі промивають (див. п. 3); 8) у лунки вносять по 0,2 мл розчину субстрату: ортофенілендіаміну (ОФД) чи 5-аміносаліцилової кислоти для пероксидази та п-нітрофенілфосфату для лужної фосфатази, інкубують у темряві впродовж 5 – 30 хв за кімнатної температури; 9) реакцію зупиняють добавлянням 0,05 мл 2 н розчину Н2SO4 для пероксидази і 3 М розчину NaOH для лужної фосфатази; 10) реакцію оцінюють візуально за відмінністю в забарвленні контрольних і дослідних зразків або, використовуючи колориметр, за довжиною хвилі: 490 нм для пероксидази й 405 нм для лужної фосфатази. Під час використання субстрату ОФД позитивні зразки мають оранжево- коричневе забарвлення, а в разі застосування 5-аміносаліцилової кислоти — інтенсивно-коричневе. Негативний контроль зовсім не забарвлений або забарвлений у блідо-жовтий колір. Лужна фосфатаза забарвлює зразки в жовтий колір. За позитивний результат приймають перевищення оптичної густини дослідних зразків над контрольними в 5 – 10 разів.