1.Принципи систематики вірусів. В основі сучасної класифікації та систематики лежить такі критерії : -тип нуклеінової кислоти, її структура; - наявність зовнішньої ліпідної оболонки; - стратегія вірусного геному ; - розмір і Морфологія віріона , тип симетрії; - форми генетичних взаємодій; - спектр сприйнятливих хазяїнів ; - патогенність; - географічне поширення; - спосіб передавання;  - антигенні властивості. На основі цих ознак віруси поділяють на порядки, родини, підродини, роди, види. Родини формуються за першими двома ознаками . Поділ на підродини, роди і види , базуються на решті критеріях. Порядки об’єднують родини вірусів з подібною організацією геному та єдиним механізмом реплікації. Для впорядкування систематики є низка правил: номенклатура має бути міжнародною та універсальною для всіх вірусів. Назва порядку закінчується на “virales”, родини – “viridae”, підродини- “viridae”, роду –“ virus”. Нині відомо понад 3500 видів вірусів, із них класифіковані 1550 в 3 порядки, 56 родин, 233 роди. 2. Критерії класифікації вірусів. Сучасна класифікація вірусів є універсальною для всіх вірусів хребетних. Головним принципом є – порівняння даного вірусу з типовим видом роду. До виду відносять групу штамів вірусу, що подібні між собою, але чітко відрізняються від інших вірусів. Види вірусів, що мають багато загальних ознак об’єднані в роди, а останні, об’єднані в родини. Всі віруси хребетних за сучасною класифікацією розділені на 25 родин( 9 ДНК-вмісні віруси і 16 РНК-вмісних).  Класифікація їх базується на основних властивостях віріонів – тип нуклеїнової кислоти, кількість ниток в ній, наявність чи відсутність зовнішньої ліпопротеїнової оболонки, та на морфології віріона. Для класифікації вірусів в наш час використовують наступні критерії: 1. Нуклеїнова кислота: тип, число ниток, процентний вміст, молекулярна маса, вміст гуаніну та цитозину.  2. Морфологія: тип симетрії чи псевдосиметрії, число капсомерів, наявність зовнішньої ліпопротеїнової оболонки, форма і розміри віріонів. 3. Біофізичні властивості: константа седиментації, плавуча щільність. 4. Білки: кількість структурних амінокислот.  5. Ліпіди. білків, їх локалізація,  6. Реплікація: місце синтезу білків, спосіб реплікації нуклеїнової кислот. Розмноження в тканинних культурах.  7. Феномени генетичних взаємодій (генетична рекомбінація і реактивація). 8. Коло чутливих господарів, особливості патогенезу інфекційного процесу; онкогенні властивості.  9. Стійкість до фізичних і хімічних факторів. 3. Одержання первинних і вторинних трипсинізованих культур. Культури клітин використовують для виділення вірусу з пат матеріалу, для ідентифікації , титрування вірусів, а також для їх підтримки при культивування. Клітинні культури поділяють на: - Первинні - Диплоїдні - Переверні Первинні отримують з різних тканин дорослих тварин та ембріональних тканинах( нирки, тестікули, легені, ембріони кур). Вони мають здатність необмежено розмножуватись. Диплоїдні –морфологічно однорідна, стабілізована культура in vitro. Вона обмежена строком життя( можно пересівати 40-50 разів). Методика отримання культури: • Від ембріона відбирають нирку не пізніше,ніж 3 години після забою. Доставляють у лабораторію у розчині Хенкса(t=+4C). Роботи проводять у стерильному боксі. З нирки знімають капсулу, відділяють лоханку. • Тканину подрібнюють ножицями, промивають розчином Хенкса та р-м Трипсину. • Відмиті шматки переносять у плоскодонну колбу з магнітом у розчин Трипсину(1см) на 10-15 хв і ставлять на магнітну мішалку. • Фільтрують через марлевий фільтр. Фільтрат розливають у центрифужні пробірки і центрифугують 10-15 хв. • Потім зливають трипсин, а осад розбавляють ростовим поживним середовищем. Через деякий час підраховують кількість клітин в 1 мл у камері Горяєва. Для посіву розводять клітина до 700-800 тис/мл. Прищеплену культуру отримують зі злоякісних та нормальних тканин таких як: нирки поросят, легенева тканина, карцинома шийки матки та гортані чоловіка. В цих клітин добре вивчина морфологія, вони швидко ростуть, пристосовані до умов in vitro, а та акож вони мають широкий спекр чутливості. Недоліками є: схильні до малігнізації (перероджування злоякісних клітин), не використовують для отримання вакцин. Для отримання вакцин використовують диплоїдні культури клітин. Вони здатні зберігати хромосомних набір і пересіюватись до 50 разів. Їх використовують інколи для отримання біопрепаратів. Методика отримання прищеплених культур: • Маємо готовий моно шар клітин у пробірках або матрацах. В них наливають розчин Версена( половину дози середовища). Ставлять у термостат на 15-20 хв, до появи перших ознак відторгнення клітин. • Виймаємо з термостата та зливаємо розчин Версена. Потім додаємо невелику кількість ростового середовища. Ретельно струшують, роблять піпетування(щоб розбити конгломерати). • Підраховують кількість клітин у камері Горяєва. Культуру клітин розводять до 100 тис/мл клітин. Заважають такими культурами з метою діагностики, визначення титру вірусу, та підтримання його при культивування. Для зараження відбирають добрий монослой, не менше ніж з 4х пробірок для контролю. З контрольних пробірок відбирають клітина і додають підтримуюча середовище. Після вносять 0,1-0,2 мл вірусовмісного матеріалу і лишають на 0,5-1 годину у термостаті для адсорбції вірусів на клітинах, у ці ж пробірки додають по 0,8-0,9 мл підтримуючого середовища. Потім щодня культури проглядають під мікроскопом спостерігаючи за змінами( цитопатогенною дією вірусів). Віруси можуть бути заокругленими по всьому шару, у вигляді виноградного грона; може з’явитися зернистість, клітини можуть стати гігантськими, сбагатоядерними. Але є віруси, що не змінюються- віруси сказу, КЧС. 4. Репродукція вірусів у чутливих клітинах. Віруси відтворюють собі подібні частки у величезній кількості і дуже своєрідними способами, та це явище називають репродукцією, тому що тут копіюються молекули нуклеїнових кислот і, відповідно до укладених в них генетичної інформації, синтезуються вірусні білки. Процес репродукції вірусів може бути умовно розділений на дві фази. Перша фаза охоплює події, що ведуть до адсорбції і проникнення вірусу в клітину, звільненню його внутрішнього компонента і модифікації його таким чином, що він здатний викликати інфекцію. Відповідно перша фаза містить у собі три стадії: 1) адсорбцію вірусу на клітинах; 2) проникнення в клітини; 3) роздягання вірусу в клітині. Ці стадії спрямовані на те, щоб вірус був доставлений у відповідні клітинні структури і його внутрішній компонент був звільнений від захисних оболонок. Як тільки ця мета досягнута, починається друга фаза репродукції, протягом якої відбувається експресія вірусного генома. Ця фаза складається з п'яти стадій: 1) транскрипції; 2) трансляції іРНК; 3) реплікації генома; 4) зборки вірусних компонентів і 5) вихід вірусу з клітини. Інфекція сприйнятливих клітин може бути продуктивною, обмеженою й абортивною.  Продуктивна інфекція відбувається в пермісивних клітинах і характеризується продукцією інфекційного потомства. Абортивна інфекція може наступити в силу двох обставин. Незважаючи на сприйнятливість до зараження, клітини можуть виявитися непермісивними, тому що у них здатні експресуватися лише деякі вірусні гени. Абортивна інфекція може бути також результатом зараження як пермісивних, так і непермісивних клітин дефектними вірусами, у яких відсутній повний набір вірусних генів.  Клітини можуть бути тимчасово пермісивними, унаслідок чого вірус або зберігається в клітинах до моменту, коли вони стають пермісивними, або в будь-який даний момент вірусне потомство утвориться тільки в деяких клітинах популяції. Цей вид інфекції визначений як рестриктивний (restrictive), або - як обмежений (restringent). Дана класифікація важлива; її значення обумовлене тим, що цитолітичні віруси, як правило руйнуючі пермісивні клітини під час продуктивної інфекції, можуть просто ушкоджувати, але не руйнувати абортивно заражені пермісивні і непермісивні клітини. Внаслідок ушкодження може відбуватися така експресія хазяйських функцій, у результаті якої клітина перетворюється з нормальної в злоякісну. Додатковим наслідком обмеженої й абортивної інфекцій є персистенція (збереження к клітині ) вірусного генома.

5. Генетична неоднорідність вірусів(популяцій/кланів). Вірусні популяції характеризуються високою генетичною неоднорідністю. Треба розрізняти такі поняття, як штам, тип (серотип), варіант, мутант, клон. Всі ці терміни в загальному означають вірус, який генотипічно відрізняється від батьківського дикого ( природного ізоляту), який представляє природну вірусну популяцію. Штам - це вірус, виділений з природної вірусної популяції від заражених господарів або об'єктів навколишнього середовища. Фактично штами називають різні дикі типи одного вірусу, які адаптовані до лабораторних умов. Наприклад, штам Fixe вірусу сказу.  Тип (серотип) визначають за нейтралізацією інфекційної активності. Наприклад, вірус інфекційної катаральної гарячки овець має 24 серотипи, а вірус африканської чуми коней - 10 серотипів.  Варіант - це вірус, який фенотипічно відрізняється від дикого типу, але разом з тим генотипічна основа цієї відмінності невідома.  Мутант - відрізняється від дикого типу за відомими генетичними ознаками. Клон - це вірус, популяція якого походить від одного віріону і представляє собою сукупність генетично однорідних вірусних часток. Природні вірусні популяції можуть добре адаптуватися до зовнішніх умов і при постійності середовища залишатися стабільними протягом тривалого часу. Проте при зміні факторів довкілля передумовою існування популяції є не збереження її в незмінному вигляді, а перебудова спадкової структури, що забезпечує пристосування до нового середовища. Ця перебудова може здійснюватися тільки при наявності в популяції запасу генетичної мінливості генотипічно різних варіантів. Генетичний склад вірусної популяції називається генофондом. Іншими словами, генофонд вірусної популяції - це сукупність всіх генів, які є у вірусів, що складає дану популяцію. Генофонд, так само як і вірусний геном, пристосований для виконання певних життєвих функцій. Спадкова інформація, що міститься в геномі, забезпечує відтворення вірусу, а генотипічна різноманітність, представлена в генофонді, дозволяє вірусам пристосовуватися і виживати в мінливих умовах навколишнього середовища.

6. Культивування вірусів у культурі клітин. Зараження, форми, цитопатогення дія. Щоб культивувати віруси у культурні клітини неаобхідно пройти такі єтапи : -добір культури клітин(якщо первинну культуру отримано з тканин природно сприйнятливих до цього вірусу, то вірус легко адаптується до неї); -отримання вірусовмісного матеріалу; -підготовка вірусовмісного матеріалу для зараження; -зараження культури клітин(відбирають моношар клітин та досліджують його під мікроскопом. Пробірки з культурою промивають р-м Хенкса попередньо зливши живильне середовище. У кулька пробірок вносять по 0,2 мл вірусовмісного матеріалу. Роблять контрольні пробірки без вірусматеріалу вносять підтримуюче середовище, герметично закупорюють пробірки та ставлять у термостат, щодня перевіряють стан контрольних та заражених пробірок); -інкубація заражених Клітинних культур; -індикація вірусу в культурі клітин здійснюють за змінами кольору підтримуючого середовища, наявністю ознак деструкції моношару, цитопатогенною дією- це різні зміни в культурі клітин під впливом вірусу, що репродукуються в них. ЦПДтвиражається у полюсах ( відсотках змінених клітин). Один + - 25%, ++++ - 100%. Також різнять три форми ЦПД: 1. Фрагментація клітини 2. Заокруглення клітини 3. Симпластоутворення( розчинення клітинних оболонок і злиття сусідніх цитоплазм, внаслідок чого утворюються великі багатоядерність клітини по периферії симпласта) -збір культурної рідини та ідентифікація в ній вірусу.

1. Взаємодія вірусів на генетичному та негенетичному рівнях.

Між вірусними геномами можуть бути такі форми генетичних взаємодій, як рекомбінація, генетична реактивація, гетерозиготність. На рівні генних продуктів виникають негенетичні взаємодії: комплементація, фенотипове змішування, інтерференція. Рекомбінація – обмін генетичним матеріалом, між батьківськими вірусами,внаслідок чого утворюється потомство з властивостями, успадкованими від обох батьків. Генетична реактивація є окремим випадком рекомбінації, коли один або обидва партнери неінфекційні внаслідок пошкодження геному, але при змішаній інфекції дають повноцінне потомство, що має ознаки обох батьків. Це потомство є рекомбінантами. Розрізняють множинну і перехресну реактивації. Множинна реактивація виникає між неінфекційними партне- рами, коли клітина заражається кількома віріонами з пошкодже- ними геномами. Зазвичай множинна реактива- ція відбувається між вірусами, інактивованими УФ-променями. Її спостерігають як між різними штамами або серотипами одного і то- го самого вірусу, так і між неспорідненими вірусами. Перехресна реактивація, або крос-реактивація, виникає між інфекційним та інактивованим вірусами. Гетерозиготність полягає в тому, що в разі змішаної інфекції різними штамами вірусу утворюються віріони потомства, які містять у своєму складі два батьківські геноми (повні гетерозиготи) або принай- мні один повний геном і частину іншого (неповні гетерозиготи.

Комплементацією, або негенетичною реактивацією, називають взаємодію генних продуктів двох вірусів, що стимулює їхнє розмноження, але не змінює генотипи. При цьому один вірус постачає іншому компоненти, яких бракує для здійснення повного циклу репродукції, зазвичай структурні або неструктурні білки. Комплементація може бути дво- та односторонньою. Двостороння комплементація виникає між дефектними вірусами, кожен з яких не здатний до самостійної репродукції. Обидва партнери забезпечують один одного потрібними генними продуктами. За односторонньої комплементації повноцінний вірус-помічник стимулює репродукцію залежного від нього дефектного вірусу-сателіта, надаючи йому потрібні білки. Фенотипове змішування — це явище, за якого геном одного вірусу упаковується в капсид або суперкапсид, що складається повністю чи частково зі структурних білків іншого вірусу. Якщо оболонка віріона (капсидна чи суперкапсидна) містить структурні білки обох батьків, такі варіанти вірусу нейтралізуються сироватками проти вихідних штамів.

Інтерференція полягає в здатності одного вірусу пригнічувати розмноження іншого.Розрізняють гомологічну інтерференцію, яка виявляється тільки стосовно гомологічного або близькоспорідненого вірусу, і гетерологічну інтерференцію, що виникає між вірусами різних таксономічних груп. Гомологічна інтерференція спостерігається і з ts-мутантами.

2. Титрування вірусів

При виділенні вірусів виникає потреба кількісного визначення їх в одиниці об’єму вірусовмісного матеріалу, що важливо для наступної ідентифікації збудника. Віруси титрують за інфекційною та гемаглютинувальною активністю, відповідно визначають інфекційний і гемаглютинувальний титри. ТИТРУВАННЯ ВІРУСІВ ЗА ІНФЕКЦІЙНОЮ АКТИВНІСТЮ. За одиницю інфекційного титру прийнята 50%-ва ефективна доза — ЕД50. Це така доза вірусу, яка спричиняє ін- фекційний ефект у 50 % заражених біологічних систем. Для визначення ЕД50 готують ряд послідовних 10-разових розве- день вірусу на 0,9%-му розчині NaCl, розчині Хенкса або середовищі для культури клітин. У кінцевих розведеннях інфекційна дія вірусу не повинна проявлятися. Кож- ним розведенням вірусу в однаковому об’ємі заражають однакову кількість чутливих тест-об’єктів (не менше 4). Спостерігають упро- довж 5 – 12 діб, враховують результати дії вірусу (загибель, клінічні ознаки, патологоанатомічні зміни. Розведення вірусу, яке зумовлює 50%-й інфекційний ефект, розраховують статистичними методами, найчастіше за методом Ріда і Менча або методом Кербера. Потім визначають, скільки ЕД50 містить такий самий об’єм нерозведеного вірусу і перераховують кількість ЕД50 на 1 см3 вірусовмісного матеріалу, що і буде показником титру вірусу.

ТИТРУВАННЯ ВІРУСІВ ЗА ГЕМАГЛЮТИНУВАЛЬНОЮ АКТИВНІСТЮ. Гемаглютинація — це здатність вірусів склеювати еритроцити за рахунок білка гемаглютиніну, який знаходиться в капсидній або су- перкапсидній оболонці віріонів. Механізм гемаглютинації полягає в адсорбції віріонів на пове- рхні еритроцитів і утворені «містків» між ними, внаслідок чого ерит- роцити склеюються й осідають на дно пробірки або лунки планшета у вигляді «парасольки». Неаглютиновані еритроцити осідають у вигляді «ґудзика». Кожний гемаглютинувальний вірус здатний склеювати еритроцити тварин певних видів, при відповід- ній температурі і рН середовища. У РГА визначають гемаглютинувальний титр вірусу. Для цього готують дворазові розведення вірусу на 0,9%-му розчині NaCI в однаковому об’ємі. До кожного розведення вірусу дода- ють однаковий об’єм 1%-ї суспензії еритроцитів* певного виду. В останню лунку вірус не вносять, а залишають для контролю еритро- цитів на спонтанну гемаглютинацію. Планшети струшують і витри- мують певний час при відповідній температурі (+4 °С, +18 – 22 °С або +37 °С) залежно від виду вірусу. Результати реакції оцінюють у плюсах після повного осідання еритроцитів у контрольній лунці.

+++ — всі еритроцити аглютиновані й утворюють суцільний шар(«парасольку»); ++ — більшість еритроцитів аглютинована й утворює «парасольку», по краях якої відмічається тонке кільце з неаглютинованих еритроцитів; + — більшість еритроцитів не аглютинована та утворює осад у вигляді «ґудзика», по краях якого є незначна «парасолька»; – — всі еритроцити не аглютиновані й осіли у вигляді «ґудзика» з рівними краями.

За одну гемаглютинувальну одиницю (1 ГАО) беруть найбільше розведення вірусу, яке спричинює чітко виражену гемаглютинацію (не менше ніж на 2 плюси). Кількість ГАО в нерозведеному вірусовмісному матеріалі виражає титр вірусу.