2 курс / Лекция 13. Биосинтез нуклеиновых кислот. Репликация

1

Лекция 13

БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ РЕПЛИКАЦИЯ ДНК

Репликация происходит в S-период интерфазы перед каждым клеточным делением. Этот процесс идёт под действием очень сложно организованных ферментов.

Миллиарды лет генетическая информация передаётся от родителей к потомству практически в неизменном виде. Эту точность обеспечивают ферменты, которые могут даже исправлять свои ошибки. Ошибки – это мутации. Т.о. точность передачи генетической информации должна быть очень высокой. Ферменты репликации решают также ряд механических проблем. Например, раскручивают молекулу ДНК со скоростью 4,5 тыс.

об/мин для создания репликативной вилки (сравните со скоростью работы центрифуги).

Возникает вопрос: две новосинтезированные цепи остаются вместе, а

две старые объединяются (консервативный тип)? Или цепи объединяются в пары, где одна цепь новая, а другая старая (полуконсервативный)?

Полуконсервативный тип – предложен Уотсоном и Криком. В каждой новой молекуле содержится 1 старая и 1 новая цепь.

Впервые экспериментально доказано, что в живых организмах репликация идет по полуконсервативному механизму, Мезельсоном и Сталем 1958 г. Опыты Мезельсона – Сталя, доказывающие полуконсервативный механизм репликации – прочитать самостоятельно к семинару.

2

Ферменты и белковые факторы репликации

Открыто более 100 ферментов и белковых факторов репликации, но функции известны менее чем для половины. Поэтому процесс репликации мы будем изучать предельно упрощённо.

1. ДНК-полимераза

Была выделена из E. coli (прокариотического организма) в 1958 г. А.

Корнбергом.

Эти ферменты присутствуют в клетке только в очень малом количестве. Для их изучения Корнберг обработал 100 кг отфильтрованных из среды клеток E. сoli и выделил только 500 мг фермента.

3

Фермент катализирует реакцию образования межнуклеотидных 3`-5`-

фосфодиэфирных связей ДНК, т.е. строит полинуклеотидную цепь.

5`-дНТФ присоединяются к 3`-ОН-концу затравочной цепи

дезоксинуклеозидтрифосфатов всех четырёх видов (5`-дАТФ, 5`-

дГТФ, 5`-дЦТФ, 5`-дТТФ (проговаривать!)).

(Зачем используются трифосфаты, если в цепи остаётся 1 фосфат? – Энергия выделяется и тратится на создание ковалентной связи).

2.Нуждается в ДНК-матрице, которая определяет порядок нуклеотидов дочерней цепи. Т.е. фермент будет брать нуклеотиды только комплементарные ДНК-матрице.

3.Нуждается в затравочной цепи со свободной 3`-ОН-группой. Т.е.

ДНК-полимераза не может сама поставить первый нуклеотид, а

присоединяет только очередные нуклеотиды к затравке.

4

Это осложняет весь процесс, но даёт ряд важных следствий.

Следствия:

А. поскольку синтез пойдет из 5`-фосфатов и они присоединяются к 3`-

концу, то фермент строит цепь только в одном направлении от 5` к 3`.

Запомним!

(Двуспиральная молекула рисуется в виде ленты со штрихом.

Там, где цепь одна – штриховка до середины).

Важно определиться с направлением синтеза от 5` к 3`.

Б. ДНК-полимераза обладает двумя активностями: полимеразной от 5` к 3` и

экзонуклеазной активностью от 3` к 5`, т.е. может отщеплять по 1

нуклеотиду.

Что значит нуклеазная активность? – Фермент гидролизует межнуклеотидные связи (экзоснаружи и эндо-внутри).

Зачем? Если ошибочно встроился нуклеотид, например, напротив Г встал А. Как узнать ошибку? Ферменту ДНК-полимеразе нужна затравочная цепь, которая служит эталоном. ДНК-полимераза выявляет стерическое

(конформационное) нарушение, возникающее при неправильном присоединении нуклеотида, путём сравнения с затравочной цепью

(эталоном). В этом случае ДНК-полимераза вырезает неправильно присоединённый нуклеотид за счёт 3`-5`-экзонуклеазной активности. В

результате точность работы фермента значительно возрастает: 1 ошибка на

109 – 1010 нуклеотидов. За счет этой экзонуклеазной активности ДНК-

полимераза вырезает неправильно присоединённый нуклеотид, т.е. может корректировать свой синтез.

В то же время РНК-полимераза, которая не корректирует свой синтез,

работает с точностью 1 ошибка на 104 –105 нуклеотидов. (Во сколько раз точность выше? Т.е. фермент ошибается редко).

5

Т.о. такая высокая точность возможна потому, что ДНК-полимераза сама не ставит первый нуклеотид, т.к. первые нуклеотиды корректировать невозможно.

Репликация – это сложнейший биологический процесс. В наших клетках 3 млрд п.н.. Фермент, катализирующий синтез комплементарной цепи ДНК, – удивительное создание природы: сам корректирующий свой синтез!

Упрокариот ДНК-полимеразы разных типов: ДНК-полимераза I, II и III (по мере открытия).

ДНК-полимераза I – 1 полипептидная цепь.

ДНК-полимераза III – мультисубъединичный комплекс, это основной фермент репликации. Холофермент.

ДНК-полимераза II – участвует в репарации.

2. ДНК-лигаза

Открыта в 1967 г.

Нет одной 3`-5`-фосфодиэфирной связи.

Это очень крупный дефект!

К чему может привести?

ДНК-лигаза катализирует реакцию образования межнуклеотидных фосфодиэфирных связей между 5` и 3`-концами фрагментов молекулы ДНК,

сближенных на расстояние одного нуклеотидного звена и закрепленных на комплементарной цепи ДНК.

Такая ситуация возникает:

6

1.При устранении разрывов одной из цепей, вызванных облучением

(УФ приводит к разрывам в ДНК), действием нуклеаз и др.

2.В процессе нормальной репликации при соединении фрагментов Оказаки.

3.При замыкании линейной молекулы в кольцевую у прокариот (а

также в процессах кроссинговера, рекомбинации).

3.ДНК-связывающие белки

Когда образуется репликативная вилка,

образуются однонитевые фрагменты.

Азотистые основания обнажаются, а это наша наследственная информация.

Есть много ферментов, которые могут пришить –СН3 группы, -ОН и т.д.

Такого быть не должно. Открытые основания защищаются специальными белками.

Эти белки выделены в 1970 г. Они входят в состав репликативного комплекса в виде димера и связываются с однонитевыми фрагментами. В

зоне репликации находится около 170 молекул белка. ДНК-связывающие Б.

находятся в репликативной вилке до образования комплементарной цепи ДНК.

Функции:

1.Защита ДНК (обнажившихся оснований, «святая святых», чтобы не было мутаций)

2.Препятствуют обратному спариванию

3.Стабилизируют репликативную вилку

4.Способствуют сохранению линейности однонитевых фрагментов.

8

ЭТАПЫ РЕПЛИКАЦИИ

1. Сложность процесса определяется свойствами ДНК-полимеразы:

А. ДНК-полимераза работает только в направлении от 5` к 3`.

Но если одновременно начать синтез в двух направлениях, то видно, что одна цепь может синтезироваться, а другая – нет,

т.к. направление не совпадает.

Поэтому Оказаки предположил,

что синтез новых цепей будет идти по-разному.

Ведущая цепь синтезируется непрерывно в направлении от 5` к 3`,

и этот фрагмент всегда будет играть роль затравки, поэтому синтез идёт без проблем.

Отстающая цепь состоит из фрагментов Оказаки (как при шитье иголкой назад).

Отстающая цепь синтезируется в виде отдельных фрагментов в направлении обратном ведущей (на рисунке сверху вниз). Поэтому каждый последующий фрагмент синтезируется встык к предыдущему. В результате отстающая цепь состоит из отдельных фрагментов, которые были названы фрагментами Оказаки. За 1 раз синтезируется 1 фрагмент. У эукариот размер фрагментов Оказаки 100 – 200 н., у прокариот – до 1000 н.

Почему? 200 п.н. ≈ 1 нуклеосома.

У эукариот ДНК связана с гистонами, у прокариот – гистонов нет.

9

Б.Вторая особенность.

ДНК-полимераза работает только в присутствии затравки и не может ставить первый нуклеотид. Затравка создается своеобразным образом: ее синтезирует фермент праймаза (это особый вид РНК-полимеразы и она создает фрагмент из рибонуклеотидов). Этот фрагмент называется праймер.

Дальше начинает работать ДНК-полимераза III и создается первый фрагмент Оказаки (он состоит из праймера и последовательности ДНК, которую синтезирует ДНК-полимераза III).

Праймер состоит из рибонуклеотидов. Его размер ≈ 10 н.

Праймер создаётся из рибонуклеотидов с точностью 1 ошибка на 104 – 105 н.,

т.к. любые нуклеотиды, которые ставятся первыми, корректировать невозможно.

Если бы праймер состоял из ДНК, то ферменты, которые потом удаляют праймер,

не могли бы потом его узнать.

Т.е. это своего рода метка, чтобы потом узнать праймер и вырезать его.

Какой недостаток у праймера? – низкая точность, т.к. ДНК-полимераза ещё не присоединилась, она не может выявлять стерические нарушения.

На отстающей цепи примерно 10% составляют праймеры. Они созданы с точностью 1 ошибка на 104 – 105 нуклеотидов. Если бы не было замены этих праймеров, то такой организм был бы не жизнеспособен. Т.е. это достоинство ДНК-полимеразы (что она не ставит первый нуклеотид), а не недостаток.

10

Этапы репликации.

Инициация Создаётся реплисома – репликативный комплекс ферментов, куда

входят все рассмотренные ферменты и более 20 белковых факторов.

Сначала ДНК-гираза раскручивает ДНК, разрезая… создавая шарнирный механизм (см. выше), затем хеликаза расплетает молекулу ДНК,

разделяя комплементарные пары (на разделение каждой пары тратится две молекулы АТФ). Образующиеся однонитевые фрагменты тут же связываются ДНК-связывающими белками.

Затем праймаза создаёт праймер, а далее работает ДНК-полимераза III

и создаётся фрагмент Оказаки..

Инициация заканчивается созданием первого фрагмента Оказаки.