2 курс / Лекция 05. Фолдинг белков

1

Лекция 5

Механизм формирования пространственной структуры белков

Постулаты Анфинсена Первые работы по изучению закономерностей формирования

пространственной структуры (фолдинга) были проведены Кристианом

Анфинсеном в 1973 г. Он изучал процесс ренатурации фермента рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка). При фолдинге этого фермента образуется 4 –S—S– связи Эти –S—S– связи образуются восемью остатками цистеина, которые про формировании третичной структуры могли бы образовать 105 различных комбинаций.

2

Анфинсен проводил денатурацию рибонуклеазы, вызывая разрыв –S— S– связи обработкой β-меркаптоэтанолом. Затем он убирал из среды денатурирующие факторы, и фермент восстанавливал свою активность. При этом возникала каталитически активная молекула, реализовывался только

один вариант из 105.

Анфинсен выделил два постулата:

1.Фолдинг белка определяется его аминокислотной последовательностью.

2.Белки принимают третичную конфигурацию самостоятельно.

Но не так давно обнаружили, что это справедливо только для небольших белков (до 200 аминокислотных остатков), к которым относится и рибонуклеаза Анфинсена. Для фолдинга крупных белков необходимы специальные белки шапероны и ферменты фолдазы. Они создают возможность для быстрого формирования пространственной конфигурации

Парадокс Левинталя Загадочность самоорганизации белка суммируется парадоксом

Левинталя. У белковой цепи есть бездна возможных конформаций.

Например, пусть каждый аминокислотный остаток имеет 10 возможных попарных взаимодействий. Если белок состоит из 100 аминокислотных остатков, то он способен образовывать 10100 возможных конформаций.

Если переход из одной конформации в другую занимает 10 —13 сек, то перебор всех конформаций должен занять 1060 лет. Но наша Вселенная существует всего 1010 лет! Белок же формирует свою нативную структуру в течение от нескольких секунд до минут.

Для большинства белков нативная структура находится под

термодинамическим контролем. При физиологических условиях состояние белка, имеющего нативную трехмерную структуру, термодинамически стабильно, т.е. соответствует минимуму свободной энергии. Во время формирования нативной структуры белка свободная энергия стремится к минимуму.

3

Существует кинетический контроль фолдинга, согласно которому полипептидная цепь перебирает различные пути свёртывания через образование промежуточных структур. Число этих структур уменьшается по мере движения к минимуму энергетического профиля.

Фолдинг схематично можно изобразить в виде фолдинговой воронки,

которая описывает термодинамическое и кинетическое поведение несвёрнутых молекул на пути к их нативному состоянию.

4

На вершине воронки – развёрнутые полипептидные цепи, обладающие высокой энтропией. Затем идёт перебор возможных вариантов свёртывания,

и их число уменьшается с каждым разом, а энергетический профиль стремится к минимуму. Нативная конформация обладает минимальной свободной энергией.

В процессе фолдинга важную роль играет феномен кооперативности:

после образования одной или нескольких первичных связей резко ускоряется замыкание других нативных связей.

Стадии фолдинга

5

6

Исходная форма продукта трансляции – случайный клубок.

1)вначале очень быстро (за миллисекунды) формируются элементы

вторичной структуры как «затравки» для образования более сложных

мотивов;

2)очень быстро происходит специфическая ассоциация элементов вторичной структуры с образованием супервторичной структуры;

3)быстро формируется расплавленная глобула с большим участием гидрофобных радикалов.

Происходит образование специфических контактов между значительно

удалёнными по аминокислотной последовательности участками. Они сближаются в третичной структуре, образуя гидрофобное ядро, происходит вытеснение воды. Начинается коллапсирование (гидрофобное сжимание клубка). Молекула приобретает пространственную структуру, близкую к нативной, но не обладающую функциональной активностью. Здесь аминокислотные радикалы ещё не нашли своих партнёров, а контактируют с кем придётся. Такое состояние белковой молекулы называют

«расплавленной глобулой». На этом этапе гидрофобные эффекты проводят до 1/3 черновой работы по созданию структуры. Далее требуется окончательная огранка – создание нативной глобулы.

4)Переход «расплавленной глобулы» в нативную структуру

связан с перебором разных конформаций и является самой медленной стадией процесса сворачивания. Это объясняется тем, что установление оптимального набора взаимодействий, стабилизирующих нативную конформацию, связано с необходимостью структурных перестроек. Они происходят медленно. На этой стадии работают специальные ферменты,

ускоряющие сворачивающие белков – фолдазы, а также белки-шапероны -

особая категория белков, основной функцией которых является обеспечение правильного характера сворачивания полипептидной цепи в нативную структуру.

7

Ферменты, ускоряющие сворачивание

(и связывающиеся только с расплавленными глобулами)

В этом процессе перехода «расплавленной глобулы» в нативную структуру задействованы ферменты фолдинга – фолдазы. Характерной особенностью этих ферментов является то, что они не способны связываться с нативными белками, а связываются только с белками, находящимися в состоянии расплавленной глобулы.

Один из ферментов катализирует образование и изомеризацию –S– S– связей и расщепление неправильных –S—S– мостиков.

Второй фермент фолдинга катализируюет цис-транс-изомеризацию

пептидной связи, предшествующей остатку пролина. При этом полипептидная цепь получает возможность поворачивать на 90 – 180º.

Шапероны и шаперонины

Середина 1980-х гг. характеризуется началом новой эры в исследованиях механизмов сворачивания белков. Было обнаружено, что в клетках существует особая категория белков, основной функцией которых является обеспечение правильного характера сворачивания полипептидной цепи в нативную структуру. Эти белки связываются с развёрнутой или частично развёрнутой молекулой белка, не дают ей формировать неправильные структуры. Удерживают частично развёрнутый белок,

способствуя его переносу в разные субклеточные образования, а также создают условия для его эффективного сворачивания. Эти белки называются

«молекулярные шапероны» (от англ. shaperon – няня).

К настоящему времени известно несколько классов шаперонов,

различающихся по структуре и функциям. Поскольку впервые шапероны были открыты как белки, синтезирующиеся в организмах при действии повышенных температур, шапероны называют белками теплового шока

9

полипептидами на участках длиной 7—9 аминокислотных остатков с гидрофобными радикалами. У белков такие участки встречаются через каждые 16 аминокислотных остатков. Это взаимодействие не является специфичным и реализуется благодаря силам гидрофобного взаимодействия.

Прочно фиксированная на шаперонах цепь не способна к сворачиванию в нативную структуру, т.к. не обладает необходимой подвижностью

Функции шаперонов:

1.Главная – удержать полипептидную цепь от неспецифической агрегации, т.е. защитить от «неправильных» взаимодействий между радикалами до окончания синтеза полипептидной цепи (т.е. до схождения с рибосомы).

2.БТШ 70 участвует в транспорте белков в органеллы через их мембраны: переносит развёрнутый полипептид к мембране (например,

митохондрий), передаёт белок через мембрану с помощью других белков-

помощников. Внутри органеллы белок встречают другие шапероны митохондрий и как бы втягивают белок внутрь и способствуют формированию нативной структуры «по месту службы».

3.Многие белки должны собираться и разбираться (например,

разборка и сборка нуклеосом до и после репликации). Шапероны контролируют этот процесс, чтобы не было ошибок.

4. При стрессах белки могут денатурировать (терять нативную структуру). Шапероны предотвращают слипание белков после денатурации и помогают образовать нужные структуры.

БТШ 70 передаёт белок другому семейству шаперонинов.

10

Шаперонины

Шаперонины обеспечивают эффективное сворачивание белков. В

отличие от просто устроенных шаперонов, -- это сложные олигомерные комплексы из БТШ 60 и БТШ 10.

БТШ 60 образует структуру из двух колец, каждое из которых состоит из семи субъединиц. Крышка комплекса состоит из семи субъединиц БТШ

10.

Каждая субъединица БТШ 60 состоит из трёх доменов: апикальный

(обогащён гидрофобными аминокислотными остатками), промежуточный,

экваториальный (обладает АТФазной активностью, т.е. может гидролизовать АТФ)