8.4.2. Практические работы

Работа 1. Разделение высоко- и низкомолекулярных веществ методом проникающей хроматографии

Наиболее часто в проникающей хроматографии применяют органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. К числу таких соединений относятся декстраны с поперечными сшивками (сефадекс). Сефадекс - это полимер в виде гранул, построенных из молекул бактериального полисахарида декстрана (1,6-глюкана), "сшитых" через определенные промежутки поперечными связками за счет взаимодействия с эпихлоргидрином.

Примерная структура ячейки сефадекса:

Чем больше число поперечных сшивок, тем меньше размеры отверстий молекулярного сита. Сефадексы очень хорошо набухают в воде, растворах солей. Получается гель-сефадекс. В зависимости от степени сшивки молекул декстрана друг с другом различные сефадексы отличаются набуханием гранул сефадекса и пределами эксклюзии (выражаемой значениями молекулярной массы веществ, еще способных входить внутрь гранул сефадекса), в связи с чем и построена классификация сефадексов.

Объекты исследования. Голубой декстран, хромат калия.

145

Оборудование и реактивы. Трубка с краном размером 20×1,2 см, софадекс G-25, голубой декстран (или гемоглобин кристаллический), хромат калия.

Выполнение работы

Сефадекс G-25 (4 г) помещают в химический стакан, заливают водой и оставляют набухать при комнатной температуре в течение 3 ч. Колонку укрепляют вертикально в штативе. Ее нижнее отверстие закрывают пробкой из стекловаты (или пористым диском из полиуретана) и наполняют на 1/3 дистиллированной водой. Из стакана с набухшим гелем сливают избыток воды, хорошо перемешивают оставшуюся в нем суспензию (объем около 50 мл) стеклянной палочкой и переносят суспензию в колонку. Нужно следить за тем, чтобы в суспензии не было пузырьков воздуха. Избыток воды из суспензии можно осторожно слить. Следующую порцию суспензии добавляют, не дожидаясь полной усадки слоя сорбента. Когда весь гель окажется в колонке, высота его должна быть около 15 см. Полностью открывают кран колонки и в течение примерно 30 мин промывают (стабилизируют) слой дистиллированной водой. При вводе в колонку растворителя нельзя обнажать поверхность слоя.

Пробу готовят, растворив 5 мг голубого декстрана и 5 мг хромата калия в 1 мл дистиллированной воды (голубой декстран растворяется медленно, лучше его растирать). В колонку добавляют небольшое количество воды, закрывают кран, пипеткой осторожно вводят в нее зеленый раствор пробы (лучше всего по стенкам трубки колонки). Затем открывают кран и после того, как проба впитается в слой геля, промывают остаток одной или двумя порциями по 1 мл воды и заливают колонку доверху водой. Больше воды в процессе данного эксперимента не добавляют. Разделенные фракции собирают в калибровочные пробирки объемом 3 мл. Однородность (чистота) зон разделенных компонентов свидетельствует о том, что колонка приготовлена правильно. Объем воды, требующийся для элюирования голубого декстрана, равен свободному объему колонки.

Работа 2. Разделение белков методом гель-фильтрации через сефадекс

Оборудование и реактивы. Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр; коллектор фракций; колонка для гель-фильтрации; пробирки химические (150 – 200 штук); склянка на 5 л; трубки каучуковые (диаметр 0,5 - 0,7 см); зажим винтовой; насос, сефадекс G-75; хлорид натрия: С(хлорида натрия) = 0,09 моль/л; реактивы для определения белка по

146

Лоури; яичный альбумин с М = 45000, трипсин с М = 22680; рибонук-

леаза c М = 13700.

Выполнение работы

Готовят гель сефадекса. Для этого 25 г сефадекса G-75 предварительно заливают в двухлитровом стакане 1,5 л раствора хлорида натрия: C(NaCl) = 0,09 моль/л, хорошо перемешивают и оставляют на 24 ч. Через сутки набухший сефадекса промывают 5 раз раствором хлорида натрия C(NaCl) = 0,02 моль/л путем декантации. Полученным гелем сефадекса заполняют колонку. Заполнение колонки ведут осторожно, заливая его медленно и непрерывно по стенке колонки, что предохраняет от захвата им пузырьков воздуха.

Сразу после внесения сефадекса в колонке создают рабочее давление, подключая к колонке пятилитровую склянку с элюирующим раствором (раствором хлорида натрия: C(NaCl) = 0,09 моль/л). Этим раствором немедленно начинают промывку колонки и ведут ее около 12 ч.

Рис. 8.6. Установка для колоночной хроматографии: 1 - коллектор фракций; 2 - колонка с сефадексом; 3 - насос;

4 - склянка с элюирующим раствором

Содержание белка в растворе, подлежащем гель-фильтрации, должно быть около 10 мг/мл. Поэтому готовят смесь белков в соотношении: яичный альбумин – 5 мг, трипсин – 3 мг, рибонуклеаза – 2 мг и растворяют ее в 1 мл раствора хлорида натрия: C(NaCl) = 0,09 моль/л.

Перед нанесением образца, предназначенного для фракционирования, отключают склянку с элюирующим раствором от колонки. Слегка ослабляют кран колонки и устанавливают уровень элюирующего раствора вровень с поверхностью сефадекса. Осторожно, стараясь ни в коем случае не взмутить верхний слой сефадекса, пипеткой наслаивают 1 мл смеси белков. Ослабляя зажим в нижней части колонки, нанесенной образец вводят в сефадекс и очень осторожно, наслоив по каплям или по стенке при помощи пипетки элюент, подключают к колонке склянку с

147

раствором хлорида натрия: C(NaCl) = 0,09 моль/л и начинают элюцию

(рис. 8.6.).

Собирают фракции по 5 мл при помощи коллектора фракций со скоростью 1 мл в минуту. Элюцию завершают после сбора 30 фракций. Содержание белка по всех исследуемых фракциях можно определять спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность каждой пробы на спектрофотометре СФ-16 при 280 нм или на фотоэлектроколориметре, предварительно проведя цветные реакции по методу Лоури. Строят выходную кривую (рис. 8.7.).

Рис. 8.7. Выходная кривая: А - абсорбция вещества во фракциях, t - время их выхода; I, II, III - белковые фракции

Отчет по работе. Он должен содержать схему прибора, рисунок выходной кривой, построенной по результатам определения количества белков во фракциях на фотоэлектроколориметре.

148