
- •13. Методы экспериментальной работы с лабораторными животными.
- •Правила обращения с животными после эксперимента.
- •14. Методы изучения цнс и внд.
- •15. Электрофизиологические методы исследования функций организма животных.
- •Анализ экг
- •16.Методы исследования висцеральных систем
- •17. Токсикологические методы исследования
- •18. Методы световой микроскопии
- •Методы световой микроскопии
- •Метод светлого поля
- •Метод темного поля
- •Метод фазового контраста
- •Поляризационная микроскопия
- •Метод интерференционного контраста
- •Метод исследования в свете люминесценции
- •19. Методы цито- и гистологических исследований
- •20. Методы микротехники
- •23. Электрохимические методы анализа (электрофорез и др.)
- •24. Хроматографические методы анализа.
- •25. Спектральные методы анализа.
- •1.По решаемым задачам:
- •2.По применяемым методам:
- •26. Кинетические методы анализа
- •28. Методы изучения ферментативной активности.
- •1 Мкмоль/мин м.Е. (международная единица)
- •29. Методы генетического (гибридологического) анализа
- •30. Методы изучения генетики человека.
- •31.Получение трансгенных организмов.
- •32. Исследование эмбриологического материала.
- •33. Методы анализа и коррекции гамет
- •34. Экологическое моделирование и прогнозирование
- •35. Антропометрические методы исследования
- •21. Методы культивирования протопластов, клеток и тканей.
- •37. Методы генной инженерии.
- •38. Методы промышленной биотехнологии.
- •39. Методы иммобилизации ферментов.
- •40. Гибридомная технология получения моноклональных антител.
21. Методы культивирования протопластов, клеток и тканей.
Биотехнология – это использование живых организмов (в основном м/о) и биологических процессов для нужд человека ( в том числе производстве) /урванцева/
Биотехнология – использование живых организмов и биологических процессов в производстве /маракаев/
Преимущества фитобиотехнологии:
1.низкая энергоемкость
2. безотходность
3. экологическая чистота
4. использование стандартного оборудования и препаратов
5. возможность проведения исследования весь год, независимо от климатических условий
6. использование незначительной площади при проведении исследования
7. стандартизованное и более высокое качество сырья
8. возможность автоматизации технологических процессов
МЕТОДЫ
Культуры тканей и клеток (Каллусные культуры и Суспензионные культуры)
Культивирование отдельных клеток
Культура изолированных протопластов
Клональное микроразмножение растений
Генетическая инженерия растений
КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ (каллусные и суспензионные)
Культура ткани растения- это выращивание in vitro стерильных искусственных условиях изолированных клеток, тканей, органов и частей.
Они позволяют изучить биохимические, физиологические процессы на уровне автономных клеток без влияния целого организма.
Этапы:
Вычленение экспланта (кусочек ткани растения = 1 см)
Помещение экспланта на питательную среду и инкубирование его в определенных условиях.
Образование первичного каллуса (до 2 месяцев)
Изолирование каллуса и перенос его на свежую питательную среду (пассажи). Периодизация пассажей зависит от скорости роста биомассы и от конкретных задач
Субкультивирование тканей на различных средах:
Твердые агаризованные среды - получение каллусной культуры
В жидкой суспензии - суспензионные культуры
Способы культивирования тканей:
На агаризованных питательных средах. Получают ткань как скопление недифференцированных клеток. В каллусной культуре есть структура.
На жидкой питательной среде. Нет структуры, суспензия клеток.
Сочетание жидкой и питательной среды
Твердый субстрат поддерживает тканевую массу на поверхности питательной среды (полиакрилгель, например)
Этапы культивирования:
взять эксплант – наименышее количество паренхимных клеток, механической, проводящей ткани и меньше воздушных полостей)
стерилизовать (сулима, пероксид водорода, этанол, перманганат калия) если в ткани живут микроорганизмы необходимо избавиться от них - антибиотики
приготовление питательной среды (набор макроэлементов, углеводов, фитогормонов, витамины, органические вещества, экстракты растений). Проавтоклавировать среду.
Создать условия культивирования
Свет, могут расти в темноте или при рассеянном свете
Влажность, 60-70%
Температура, 25-26 градусов, при органогенезе- 18-20
Подбор условий индивидуален от вида и от получения продукта
Ростовая кривая каллуса (в лекции)
Дифференцировка и каллусогенез.
Когда масса клеток образуется, то начинается этап дифференцировки in vitro. Данный этап очень важен для практики, так идет значительное накопление вторичных продуктов в разных частях. Например, люпин накапливается в корнях.
Дифференцировка - к состоянию делящейся клетки.
Особенности дифференцировки:
Ауксины вызывают переход из R в S фазы (клеточный цикл)
Цитокинины необходимы для завершения S фазы
Стимулируется синтез всех форм РНК
Исчезают транспецифичные белки-антигены
Появляются белки, специфичные для делящейся клетки и каллусных тканей
Прекращаются митозы
Увеличивается объем клеток, и теряется характерна форма клетки
Изменение структуры ядра и цитоплазмы
Возможна цитодифференцировка (капли жира, формирование пластид, образование везикул, образование вакуолей).
Конечный этап – формирование целого организма (растение0регенерант), из семян - сеянец.
Селекция в культуре тканей. Необходимо для отбора наиболее ценных материалов, где больше синтез вторичных метаболитов.
Методы селекции:
Отбор форм, оказавшиеся наиболее эффективными ( другая окраска, клетки крупнее)
Селекция колонии определенного морфологического типа
Селекция мутантов, устойчивых к токсическому предшественнику
Выделение ауксотрофных мутантов
Получение мутантов, устойчивых аналогам аминокислот
Получение штаммов путем обработки клеток химическими веществами, индуцирующие увеличение плоидности
Селекция устойчивых рекомбинантных штаммов
Особенности каллусных клеток:
Не имеют строго определенной анатомической структуры
Цвет зеленоватый, желтоватый коричневатый
Происхождение и условия выращивания определяют характер ткани
При длительном культивировании они теряют пигментацию и становятся более рыхлыми
Клетки в каллусной культуре проходят обычный онтогенез
Химический состав каллусной ткани и ткан организма, как правило, различаются
Используют данную культуру для сохранения в растущем состоянии коллекции штаммов линии мутантов, получение суспензии клеток и для регенерации растения.
СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ
Берут каллусную клетки и помещают в жидкую среду, ставят на мешалку.
Особенности суспензионной культуры:
Клетки культивируются в жидкой среде, во взвешенном состоянии( не контактируют с другими клетками)
Культивироваться могут как отдельные клетки, так и небольшие группы или агрегаты клеток
Этапы:
Взять каллусную ткань(2-3 г) и поместить в жидкую питательную среду
Перемешать на качалке
Провести серию субкультивирования
Выращивают культуру в системе (открытая, закрытая) с режимом (периодический, проточный)
Что дают суспензионные культуры - (получают самые разные химические соединения и синтез вторичных метаболитов)
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Источники клеток: 1. Клеточные суспензии
2.за счет мацерации тканей растения (из мезофилла листа)
3.изолированные протопласты
1. выделение клеток из суспензии:
Используют микроманипуляторы.
Часто путем последовательных разбавлений (фильтрование клеточной суспензии).
Необходимо чтобы клетки на питательной среде только росли, а не делились. Это выполняется двумя способами: выращивание с помощью «кормящего слоя» и использование «ткани-няньки».
2.культура изолированных протопластов
Протопласты - ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды и характерной структурной целостностью и способных осуществлять активный метаболизм, выполнять биосинтез трансформацию энергии.
Способы выделения протопластов:
Механический (плазмолизирование клеток или снимается эпидермис с поверхности органа и протопласты выходят в среду) – можно выделить только небольшое число протопластов, длительный и трудоемкий и тд.
Энзиматический (используют растворы ферментов) – ряд преимуществ, но необходим индивидуальный подбор ферментов
Этапы:
Отделение экспланта
Стерилизация
Промывка в стерильной воде
Снимается эпидермис, режут на кусочки и обрабатывают ферментами
Очищают от остатков ткани (фильтрование с центрифугированием или метод флотации)
Культивирование либо методом жидких капель или методом платирования.