Enzimologiia

Энзимология

51

Методы определения ферментных белков

Различают две группы методов определения:

Неразрушающего контроля. Определение происходит, не нарушая хода реакции

Методы физические (чаще под этим подразумевают оптические методы). Беспрерывная регистрация, сохраняется возможность менять условия.

Метод отбора проб. Создается реакционная среда определенного объема, от которого отбираются аликвоты, в которых останавливается реакция и производятся измерения.

Больше аналитический способ. Плюсы:

Метод цветных реакций.

Осаждение полимеров. В этом методе важно точно выявить линейный участок в методе отбора проб.

Факторы, останавливающие реакцию:

• Физические. Нагр вание

• Химические. Кис ота/щ лочь

Использование и выделение ферментов. Пути исследования ферментов.

Фермент исследуется исключительно, как белок, определяют его:

• Функционирование и структурные исследования

•Определение массы и так далее

Для исследования берется всегда абсолютно чистый белок.

Исследование ферментативной активности

Для полноценного исследования необходима чистка фермента от примесей, которые могут влиять на активность, так как наличие любых примесей увеличивает недостоверность результатов.

Аналитические свойства ферментов.

Определение веществ через специфические ферменты.

Требования:

Никаких побочных активностей

Энзимология

52

Не всякий фермент подходит Реакция должна идти до конца. Для этого берут специальные

окислительно-восстановительные реакции, для сдвига реакции. Подходят различные кофакторы.

Измеряют по воздействию на фермент.

Ферменты, как препаративные агенты в синтезах.

Таки ферменты используют для получения специальных продуктов и разделения стереоизомеров. К примеру, химический синтез кислоты, получаются изомеры, а затем полученные изомеры гидрализуют ферментом и в качестве продукта получается строго определенный изомер.

Локализация белков в живом организме

Есть эукариоты и прокариоты, в прокариотах все примитивно. Их описывают как гомогенную систему, с количеством ферментов около 2500. Есть мономерные единицы для ферментов их синтеза.

Где они и какПолесГУведут внутри живого организма?

Функции ферментов в клетке:

• Некоторые ферменты ассоциированы мембранами, синтез липидов.

• Некоторые ферменты работают на экспорт, продукты, поставляемые ими, нужны вне клетки, поэтому идет плотное сообщение с мембранами клеток.

• Некоторые пр цессы идут в пределах клеточной стенки, и это ферменты

переплазматической локализации (дефосфорилирование).

• В клеточной стенке ферменты, отвечающие за синтез и расщепление питательных веществ.

• Белки ЭТЦ(Электронотранспортная дыхательная цепь) С ферментами эукариот все сложнее

Сложные структуры связаны с ферментативными процессами:

•Белки митохондрий, наличие двух источников: МТХ геном и ядрышко. Большинство ферментов кодируются в ядре и переносятся спец системами в мтх специальными переносчиками.

•Белки пластид, примерно все то же что и в митохондриях.

•Ферменты, расщепляющие вещества находятся в пероксисомах.

Ферменты в составе клеток. Использование:

•Получение стероидных препаратов

•Гормонов

Энзимология

53

•Подбираются с помощью МКО (микроорганизмов)

Ферменты в бытовых процессах.

К примеру:

Стиральные порошки с ферментами, разлагающие жиры или липиды. Требования: ферменты должны выдерживать жесткие условия (рН, ), должны являться термофилами, должны иметь устойчивость к денатурации.

Модификация продуктов питания, те же ферменты, расщепляющие лактозу.

Медицинское значение ферментов:

A. Компенсация отсутствия ферментов при жизни. B. Тромболитические ферменты.

Необходимо помнить, что выделяемый фермент – белок. Значит, нужно учитывать наличие протеаз, чем их меньше, тем нам удобнее, так как все пройдет без разрушений и разрывов.

Процесс выделения какого-либо белка начинается с переведения белков ткани в раствор. Д я этого ткань (материал), из которой получают фермент, тщательно изме ьчают в гомогенизаторе в присутствии буферного раствора. Для лучшего разрушения клеток к материалу добавляют кварцевый песок, если материал растирают в ступке. В результате получают кашицу - гомогенат. Если не проводилось предварительное фракционирование органоидов клетки, гомогенат содержит обрывки клеток, ядра, хлоропласты и другие органоиды клеток, растворимые пигменты и белки.

Выделение ПолесГУферментов.

При выделении ферментов из тканей живых организмов, в том числе растительных, необходимо соблюдать условия, не вызывающие денатурацию белка. Все работы проводят при пониженной температуре (40С) и при оптимальных для данного фермента значениях pH среды буферного раствора.

После перевода ферментов из ткани в растворенное состояние гомогенат подвергают центрифугированию для отделения нерастворимой части материала, а затем в отдельных фракциях экстрата-центрифугата выделяют следуемые ферменты.

Так как все ферменты являются белками, то для получения очищенных препаратов ферментов применяются те же способы выделения, что и при работе с белками.

Методы выделения:

1.осаждение белка органическими растворителями;

Энзимология

54

2.высаливание;

3.метод электрофореза;

4.метод ионообменной хроматографии;

5.метод центрифугирования;

6.метод гельфильтрации;

7.метод аффинной хроматографии, или метод хроматографии по

сродству;

8.избирательная денатурация.

Методы очистки ферментов.

Сначала фермент требуется извлечь из объекта.

Есть два пути решения задачи:

2. Внутриклеточные ферменты. Ферменты находятся в клеточных жидкостях и тому подобному. Необходимо разрушить клетку, но достаточно опционально.

1. ВнеклеточныйПолесГУфермент, и нужно просто удалить клетки, тут трудностей меньше всего

Физические методы

Далее перечислен ряд физических методов.

Гораздо проще разрушать животные клетки суспензией, которая разрушает только б чки. В таких случаях пользуются методом гидродинамического сдвига.

Метод представляет собой продавливание прессом, вероятно, самый распространенный и самый полезный метод разрушения клеток.

Некоторое количество суспензии (объемом 5—40 мл с содержанием клеток до 30 об. %) помещают в стальной цилиндр с плотно пригнанным поршнем, имеющим маленький выпускной клапан с узким отверстием с клапаном соединена выводящая трубка. Цилиндр с поршнем ставят под 10тонный гидравлический пресс.

По мере того как поршень опускается, клетки разрушаются большими гидродинамическими силами, возникающими при прохождении клеточной суспензии через отверстие выпускного клапана. У этого метода есть ряд

преимуществ:

· Во-первых, нет проблемы с охлаждением, так как цилиндр и поршень пресса охлаждают заранее, а нагрев происходит только при прохождении клеток через отверстие клапана. Температура вытекающей жидкости повышается на 5—10 °С, но эту жидкость можно быстро

Энзимология

55

охлаждать, если собирать в металлическую пробирку или стакан, помещенные в ледяную баню.

· Во-вторых, разрушение происходит практически мгновенно, и суспензия разрушенных клеток не подвергается дополнительным гидродинамическим воздействиям, которые могли бы повредить субклеточные частицы.

Недостаток:

Малые объемы.

Далее описывается более грубый физический метод:

Способ блендера, из плюсов – облегчение при работе с животными тканями.

Суспензию клеток помещают в емкость, в которой происходит перемалывание ПолесГУклеток до состояния гомогената, с последующим высвобождением содержимого клеток.

Чуть мягче физический метод:

Конусная растирка. Представляет собой некую модификацию мясорубки, с одного конца подает я поток гомогената клеток и проходит через

Плюсы:

• Возможность работы с большими объемами

• Разрушение животных клеток

• Разрушение клет чных стенок грибов, бактерий

Растирание кварцевым песком.

Растирание биомассы происходит собственно вручную, с помощью подручных приспособлений и специальных полимерных гранул.

Минусы: Требуется охлаждение Плюсы: Точность метода

Шаровая мельница Принцип метода построен на постоянном прокручивании валиков с содержимым и его последующее перемалывание до гомогенного состояния (рисунок 8.1).

Энзимология

56

Рисунок 8.1. — Схема устройства шаровой мельницы

Использование прессов продавливанием раствора через тонкие каналы, вследствие чего клетки лопаются под давлением в 10-100 атм. Нужно точно подогнать поршень и сосуд. Существуют модификации:

• Продавливание замороженной суспензии, в конце происходит перекристаллизация, не происходит нагревания

• Проточная система для гомогенизации суспензий. Есть камера с коническим входом и отверстием. Под давлением подается жидкость, а с другой стороны прижат баек на пружине. Как только произойдет сброс давления и его предыдущее повышение, баек будет часто двигаться и гидравлическим удар м г м генизировать жидкость.

Мощный вариантПолесГУразрушения.

Выдавливание клеток.

· Деформирование колебаниями ультразвуковыми

Минусы: Максимальное выделение тепла, не рекомендуется держать дольше 20 секунд

·Физико-химические, химические, биологические методы.

·Использование детергентов (поверхностно активные синтетические вещества).

Используются в основном не ионные, с гидрофильной частью детергенты, которые заменяют фосфолипиды и приводят к фрагментации мембраны. Сильные ионы не используют из-за больших рисков повреждений.

Использование реагентов, которые разрушают стенки клетки или которые стимулируют разрушение.

Шоковые методы.

Энзимология

57

•Насыщение газом. Помещают в емкость и накачивают азот, выдерживают около получаса, потом резко сбрасывают газ и происходит разрыв клетки за счет разницы давлений.

Минусы: есть риск пенообразования.

•Осмотический шок. Помещают в раствор с проницаемым компонентом, который легко проникает через мембраны (глицерин, глюкоза, сахароза и так далее). Доводят до огромной концентрации, а потом резко разводят раствор, и клетки интенсивно поглощают воду, разрушаясь.

Биологические методы.

Под действием ферментов:

•ЛизоцимПолесГУ, осуществляет расщепление углеводных цепей клеточной стенки, и клетка распадается. Получают из белка яйца. Дальше два пути с ферментом, просто обработать клетки, а можно поместить в изотоническую среду, и растворится только стенка, образовав протопласт или сферопласт.

•Хеликсаза. Фермент пищеварения виноградной улитки. В итоге получаем гомогенат и некую растворимую часть.

После получения гомог ната возникает задача отделить нужную для работы часть, как это сде ать?

Есть риск того, что в этом гомогенате возникнут неблагоприятные условия для активности фермента, в основном риск заключается в изменении рН.

Условия, приемлемые для существования фермента в растворе:

•Стабилизирующий буфер. Далее дополняем среду и создаем необходимые условия для фермента

•Кофакторы

•рН

•Температура

Получение белков в чистом виде.

Есть несколько уровней задач. Если в исследовании важна именно структура, то используют именно чистый белок. Если преследуются цели для технического использования и изучения кинетических свойств, то примеси очищаются не полностью.

Два класса примесей:

•Небелковые примеси. Характерна относительная простота удаления за счет различия в структурном строении и свойствах

•Белковые примеси

После получения первичного гомогената, удаляем примеси, желательно

Энзимология

58

как можно быстрее.

Удаление низкомолекулярных примесей осуществляется путем диализа (очистка коллоидных растворов и субстанций высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощи полупроницаемой мембраны).

Процесс достаточно медленный, требуется много растворителя, чем больше, тем лучше. Иногда делают ступенчатым.

Капиллярный диализ. То же самое, только еще мельче, а следовательно, и увеличивается чувствительность метода. Внешнее пространство – раствор, внутреннее

– гомогенат. Минусы:

•Полностью очистить нельзя, но уровень все равно низок

•Процесс медленныйПолесГУ

Плюсы:

•Объемы большие Иногда примеси не удаляют, а попросту осаждают белок. Однако, при

удалении воды возможно слипание белков и димеризация, тем самым образуется белковый осадок.

Высаливание.

Принцип:

В белковый раствор добав яют высокие концентрации ионов, которые вызывают слипание белк в при связывании воды. Соль должна быть растворимой и не должна влиять на белок. Никаких солей тяжелых металлов, никаких восстановителей/окислителей, никаких фосфатов и так далее.

Хорошей солью может стать сульфат аммония. Экстракт разделяют на порции и разливают в пробирки, затем в каждую добавляют сульфат аммония в соотношениях в процентах от насыщенного. Далее берут либо раствор, либо осадок. Сначала активности нулевые, потом активность постепенно поднимается. В итоге мы получим диаграмму осаждения при разных концентрациях. Далее растворы отсортировывают по концентрациям.

Иногда белок осаждается раньше.

Плюсы:

•Осаждаются только белки и ничего больше,

•Большая стабильность с солью.

Органические растворители.

При взаимодействии с водой хорошо гидратируются. Используют либо этанол, либо ацетон. Смешиваются в любых соотношениях и обладают хорошей гидрофобностью.

Необходима хорошая чистка веществ. Растворители удобнее, так как их

Энзимология

59

можно перегнать. При смешении возможна денатурация, поэтому нужно

охлаждение:

•Теплоотвод

•Медленное смешивание

•Ледяная баня

Однако тщательное перемешивание, может быть опасно вспениванием (денатурация белка), так что это делают в толще раствора.

Осадки нельзя высушивать на воздухе, так как происходит разрушение структуры. Поэтому сушат всегда под вакуумом или повторно растворяют.

Методы дезинтеграции клеток

Выделение и очистка ферментов пожалуй самый сложный процесс в энзимологии, требующий знаний особенности выделяемого фермента и его

источника, культурыПолесГУпроведения тонких анализов. Каждый отдельный

фермент требует к себе особого внимания и подхода. Большинство ферментов выделяют при низких температурах во избежание инактивации. Существуют много способов выделения ферментов как в лабораторных условиях, так и в промышленности.

основные способы:

1. дезинтеграция,

2. экстракция,

3. осаждение (выса ивание),

4. хроматография,

5. электроф рез.

Дезинтеграция клеток. в зависимости от локализации по отношению к

клеточной мембране фермента бывают внеклеточные (экзоферменты), внутриклеточные (эндоферменты) и мембранные или клеточносвязанные. Если мы получили (вырастили) суспензию клеток или культуральную жидкость, ферменты будут по разному распределятся в этой жидкости. Некоторые ферменты выделены клетками наружу и находятся в к/ж, некоторые сидят в стенках клеток, некоторые заключены в клетки. Ясно, что для выделения первых можно клетки не трогать, просто отделить, а вот для выделения 2-х и 3-х необходимо разрушить клетки.

Процесс разрушения клеточной стенки называют дезинтеграцией.

•-физические: осмос и термошоки, плазмолиз, криотехника, ультразвук, сушка, ионизирующая радиация, температура;

•-химические: действие кислот, щелочей, солей, органических

растворителей, ПАВ, сдвиг рН;

Энзимология

60

•-энзиматические: действие литических ферментов (лизоцим;

•-биологические: действие фагов, антибиотиков.

Чаще всего первой стадией получение ферментов является получение гомогената. Гомогенат получают измельчением биологического материала (растительная или животная ткань, мицелий и т.д.) в ступке с добавлением песка или осколков стекла, или в специальных гомогенизаторах. В настоящие время применяют различные модели гомогенизаторов. Основной принцип работы этих аппаратов заключается в следующим: в стеклянной или металлическом стакане поступательно-вращательно перемешивается хорошо подогнанный к стенкам стакана металлический, стеклянный или фторопластовый шток. Предварительно измельченная биологическая ткань попадая между стенкой и штоком с наконечником механическим

разрушаются. Подбирая обороты, тип гомогенизатора, среду можно выделить очень большойПолесГУкласс ферментов.

В последние время очень широко применяют З-дезинтеграторы. Здесь

также необходимо подобрать такие условия, чтобы исключить максимально инактивацию ферментов. Хорошим способом разрушения большинства микробных клеток является перематывание шариками, состоящие во

встряхивании клеток маленькими теклянными шариками в быстро

вибрирующем сосуде.

Дезинтегрирующие действие химических соединений заключается в нарушение меж. И внутримо екулярных связей между структурными элементами клеточной стенки за счет связывание ионов металлов, удаление липидов и т.д.

При энзиматической дезинтеграции можно выделять малоустойчивые внутриклеточные структуры. Ферменты или ферментные комплексы литического действия получают из бактерий, грибов, тканей животных и растений. Например, в состав дрожжелитического ферментного комплекса входят различные глюконазы, протеазы, хитиназы. Из-за различия в строение клеточных стенок в зависимости от рода, вида, штамма одних и тех же клеток, в каждом конкретном случае необходимо подбирать соответствующий ферментный комплекс. Особенно большой скачок в использовании энзиматической дезинтеграции был сделан после применение иммобилизованных ферментов.

Биологическая дезинтеграция осуществляется фагами, бактериоцинами вызывающих лизис клетки ведущий и распаду клетки. Если ферменты прочно связаны с внутриклеточными структурами, то вначале выделяют эти структуры дифференциальном центрифугированием, а затем экстрагируют из них ферменты органическими растворителями или водными растворами дозоксихолата, твина и т.д. (детергенты).