Enzimologiia

Энзимология

21

фермента. Роль остальных аминокислотных остатков состоит в обеспечении правильной конформации молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции.

Активный центр на всех этапах ферментативного катализа нельзя рассматривать как пассивный участок для связывания субстрата. Это комплексная молекулярная "машина", использующая разнообразные химические механизмы, способствующие превращению субстрата в продукт.

В активном центре фермента субстраты располагаются таким образом, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в непосредственной близости друг к другу. Это свойство активного центра называют эффектом сближения и ориентации реагентов.

Такое упорядоченное расположение субстратов вызывает уменьшение энтропии и, как следствие, снижение энергии активации (Еа), что определяет каталитическую эффективностьПолесГУферментов.

Активный центр фермента также способствует дестабилизации межатомных связей в молекуле субстрата, что облегчает протекание химической реакции и образование продуктов. Это свойство активного центра называют эффектом деформации убстрата.

Энзимология

22

ТЕМА № 4: МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Вопросы к экзамену

1.Механизм действия ферментов.

2.Стадии ферментативного катализа.

3.Причины ускорения реакции на I стадии, причины снижения энергии активации.

4.Основы кинетики ферментативных реакций; Стандартная единица фермента, Энергия активации.

Механизм и стадии ферментативного катализа

НеобходимойПолесГУстадией ферментативного катализа является соединение фермента E с субстратом S, в результате чего образуется ферментсубстратный комплекс ES:

E + S ↔ ES→ P + S

Процесс ферментативного катализа можно разделить на три стадии:

1) диффузия субстрата к ферменту и образование ферментсубстратного комплекса (ES);

2) преобразование первичного комплекса в один или несколько активированных фермент-субстратных комплексов (ES*, ES**…);

3) отделение пр дукт в реакции (Р) от активного центра и диффузия его в окружающую среду.

Ферменты не могут влиять на положение равновесия ускоряемых реакций; при этом в ходе реакций они не расходуются и не претерпевают необратимых изменений. Ферменты термодинамической точки зрения ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации путем увеличения числа активированных молекул, которые на более низком энергетическом уровне становятся реакционноспособными.

Химическая реакция – это результат столкновения молекул, который зависит от величины энергии молекул и от прочности той связи между атомами в молекуле, которая должна быть разорвана. Молекул с очень низкой и очень высокой энергией мало, большинство молекул обладает средним запасом энергии. Они и определяют скорость реакции.

Способы ускорения химических реакций:

1.Увеличить среднюю энергию молекул

2.Снизить энергетический барьер реакции

Энергетический барьер реакции – это значение энергии, когда все молекулы взаимодействуют.

Энзимология

23

Первая стадия (I) обычно непродолжительна и зависит от концентрации субстрата в среде, а также его диффузии к активному центру фермента. Комплекс образуется практически мгновенно.

E + S ↔ ES – образование фермент-субстратного комплекса. Протекает очень быстро. Субстрат присоединяется к якорному участку активного центра. В 1894 г. Фишер предложил модель взаимодействия фермента с субстратом «ключ-замок», т.е. субстрат подходит к ферменту как ключ к замку. Согласно этой модели у фермента имеется окончательно сформированный активный центр еще задолго до взаимодействия с

субстратом. Эта модель объясняла абсолютную специфичность фермента и не могла объяснить относительной, поэтому Кошланд предложил модель «индуцированного соответствия». Согласно этой модели, окончательное формирование активного центра фермента происходит в момент взаимодействия ПолесГУсубстратом, т.е. при связывании субстрата с якорным

участком активного центра происходит изменение конформации каталитического участка активного центра, обеспечивающее его комплементарность поверхности субстрата.

Причины ускорения реакции на I тадии:

1. Происходит сближение и правильная ориентация молекул субстрата в области активного центра ф рм нта.

2. Это приводит к уве ичению эффективной концентрации молекул субстрата (т.е. тех м лекул, которые взаимодействуют), т.к. в растворе без фермента их столкновения были случайны.

Вторая стадия (II) наиболее медленная и лимитирует скорость всего катализа в целом. Её длительность зависит от энергии активации данной химической реакции. Образование фермент-субстратного комплекса способствует снижению энергии активации Еа, для достижения молекулой субстрата переходного (активированного) состояния и осуществления реакции (рисунок 4.1). По завершении реакции (конечное состояние) фермент-субстратный комплекс распадается на продукт (продукты) реакции и фермент.

На II стадии: фермент-субстратного комплекса происходит химическая реакция через переходное состояние ЕS EZ, где Z – это уже не субстрат, но еще и не продукт. Именно эта стадия лежит в основе субстратной специфичности фермента. Неспецифические (непродуктивные) взаимодействия субстрата с ферментом нарушаются при образовании переходного состояния, при специфическом взаимодействии на стадии переходного состояния происходит резкое увеличение скорости реакции. На этой стадии происходит ускорение реакции вследствие уменьшения

Энзимология

24

энергии активации (рисунок 4.2).

Рисунок 4.1. — Влияние фермента на энергетический барьер и энергию активации

Причины снижения энергии активации:

1. Фермент передает часть своей энергии субстрату в ходе взаимной подгонки конформации субстрата и фермента. Субстрат в ходе взаимодействия активным центром фермента деформируется (растягивается на активном ц нтре как на «дыбе» – гипотеза «дыбы»), что облегчает разрыв его связей.

2. Уменьшается энергетический барьер реакции путем разбивки ее на ряд промежуточных стадий, каждая из которых имеет низкий энергетический барьер.

ПолесГУреакции

Рисунок 4.2. — Снижение энергии активации под действием ферментов

Энзимология

25

Третья стадия (III) практически мгновенна. Она определяется скоростью диффузии продуктов реакции в окружающую среду. Фермент по окончании реакции возвращается в своё исходное состояние и может взаимодействовать с новой молекулой субстрата.

ЕР → Е+Р происходит очень быстро, выделяется продукт реакции, а фермент выделяется в неизменном количестве и качестве.

Основы кинетики ферментативных реакций

Ферментативная кинетика изучает скорости реакций, катализируемые конкретными ферментами, а также закономерности влияния природы реагирующих веществ на скорости ферментативных реакций. Отличительная особенность ферментативных реакций – явление насыщения активного центра фермента субстратом.

количеством прореагировавшего субстрата или образовавшегося продукта реакции в единицу времени в единице объема при определенных условиях:

где v – скорость ф рм нтативной реакции, – изменение концентрации субстрата или продукта реакции, t – время.

Скорость ферментативн й реакции зависит от А. концентрации субстрата [S]

Б. количества присутствующего фермента [Е].

Скорость ПолесГУферментативной реакции определяется химическим

В большинстве биохимических реакций концентрация фермента очень мала, а субстрат присутствует в избытке. При проведении ферментативной реакции в условиях избытка субстрата скорость реакции будет пропорциональна концентрации фермента. Графическая зависимость такой реакции имеет вид прямой линии (рисунок 4.3):

Рисунок 4.3. — Зависимость скорости ферментативной реакции (v) от концентрации фермента

Энзимология

26

Количество фермента часто невозможно определить в абсолютных величинах, поэтому на практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента.

Стандартная единица фермента – это такое количество фермента,

которое катализирует превращение одного микромоля (мкМ) данного субстрата за одну минуту при заданных условиях.

Стандартная единица фермента обозначается буквой Е (единица) или буквой U (unit).

Катал – каталитическая активность, при которой ферментативная реакция осуществляется со скоростью равной 1 молю в секунду в заданной системе измерения активности. Каталитическая активность в 1 катал (кат) при практическом применении оказывается слишком большой величиной, поэтому в большинстве случаев каталитические активности выражают в

следующих соотношениях:

микро-каталах (мккатПолесГУ), нано-каталах (нкат) или пико-каталах (пкат). Стандартная единица фермента находится и катал находятся в

1 кат = 1 моль S/cек = 60 моль S/мин = = 60х106 мкмоль/мин = 6х107 E (U);

1 Е (U) = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/с = = 1/60 мккат = 16,67 нкат.

Концентрации субстрата [S] определяет, сколько молекул фермента соединится с субстрат м бразованием фермент-субстратного комплекса [ES]. При малых [S] скорость реакции возрастает пропорционально концентрации субстрата. Однако при достаточно большом увеличении скорость реакции перестает зависеть от [S] – наступает насыщение, когда все молекулы фермента оказываются занятыми субстратом (рисунок 4.4).

Рисунок 4.4. — Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

На графике (рисунок 4.4) показано, что Km равна концентрации

Энзимология

27

субстрата [S], при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от Vmax. Km имеет размерность моль/л.

Константа Михаэлиса является важным параметром при исследовании ферментов, характеризующим степень сродства фермента к субстрату.

Константа Михаэлиса численно равна отношению суммы констант скоростей реакций, в которых фермент-субстратный комплекс распадается, к константе скорости реакции, в которой он образуется (4.1):

(4.1)

Определение величины Кm имеет важное значение при выяснении механизма действияПолесГУэффекторов на активность ферментов.

Классическое уравнение Михаэлиса-Ментен выводят из следующей кинетической схемы реакции:

Энергия активации – это дополнительное количество энергии, которое необходимо дать мол куле для преодоления энергетического барьера (или для достижения переходного состояния), т. е. это энергия, необходимая для перевода всех м лекул мо я вещества в активированное состояние. Ферменты ускоряют реакцию путем снижения энергии активации за счет увеличения числа активизированных молекул, которые становятся реакционноспособными на более низком энергетическом уровне.

Для измерения каталитической активности ферментов используют такие показатели, как корость реакции или активность фермента. Скорость ферментативной реакции определяется изменением количества молекул субстрата или продукта за единицу времени. Скорость ферментативной реакции — мера каталитической активности фермента, её обозначают как активность фермента.

Математически скорость ферментативной реакции выражается в изменении концентрации субстрата (уменьшение) или продукта (увеличение) за единицу времени (4.2):

На начальном этапе [0 — t0] скорость реакции прямо пропорциональна времени и имеет линейную зависимость. Графически изменение скорости ферментативной реакции определяется тангенсом угла наклона касательной к

Энзимология

28

кривой профиля реакции. Чем больше угол наклона, тем больше изменение скорости реакции (рисунок 4.5).

Рисунок 4.5. — Зависимость накопления продукта (А) и убыли субстрата (Б) от времени (продолжительности) протекания реакции

Скорость ферментативной реакции определяется изменением концентрации продуктаПолесГУили субстрата за единицу времени. В реакциях, катализируемых ферментами 1 и 2, начальная скорость реакции, катализируемой ферментом 1, ниже, чем скорость реакции, катализируемой ферментом 2, так как тангенс угла наклона касательной к кривой профиля реакции, проведённой из «0» точки у второго фермента выше, как в случае накопления продукта (А), так и убыли субстрата (Б). Скорость в любой момент времени t определя тся тангенсом угла наклона касательной к профилю реакции в момент вр м ни t. Период времени ферментативной реакции [t0 - t1] характеризуется линейным накоплением продукта (или убылью субстрата) в зависимости от длительности реакции. Период ферментативной реакции [t1 – tx] характеризуется нелинейным накоплением продукта (или убылью субстрата) в зависимости от времени реакции.

С течением времени изменение скорости ферментативной реакции в экспериментальных условиях уменьшается, об этом свидетельствует уменьшение угла наклона касательной в момент времени 1. Снижение скорости ферментативной реакции может происходить за счёт ряда факторов: уменьшения концентрации субстрата, увеличения концентрации продукта, который может оказывать ингибирующее действие, могут происходить изменения pH раствора, инактивация фермента и т. д.

На этапе [t1- tx] скорость реакции изменяется нелинейно в зависимости от времени. Поэтому для определения скорости ферментативной реакции чаще всего исследуют изменение скорости на начальном этапе [t0 - t1], где наблюдают линейное изменение концентрации продукта (или субстрата).

Скорость ферментативной реакции зависит от ряда факторов, таких как количество и активность ферментов, концентрация субстрата, температура среды, pH раствора, присутствие регуляторных молекул (активаторов и ингибиторов).

Энзимология

29

ТЕМА № 5: МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА И СПЕЦИФИЧНОСТЬ

ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Вопросы к экзамену

1.Молекулярные механизмы ферментативного катализа; Кислотноосновной катализ, Ковалентный катализ.

2.Специфичность действия ферментов, специфичность по отношению к субстрату, специфичность по отношению к реакции.

3.Функциональная организация ферментов.

4.Регуляция биосинтеза ферментов.

5.Изоферменты.

6.МультиферментныеПолесГУсистемы. основной

катализ - часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований.

2. Ковалентный катализ

Ковалентный катализ основан на атаке нуклеофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента.

Специфичность действия ферментов

Различают специфичность по отношению к типу химической реакции,

Энзимология

30

катализируемой ферментом, и специфичность по отношению к субстрату.

Эти два вида специфичности присутствуют у каждого фермента.

•Специфичность по отношению к субстрату

Это предпочтительность фермента к субстрату определенной структуры по сравнению с другими субстратами. Различают 4 вида субстратной специфичности:

1.Абсолютная – фермент катализирует превращение строго определенного одного субстрата. Например, уреаза расщепляет только мочевину, аргиназа – аргинин.

2.Относительная – фермент катализирует превращение нескольких субстратов, имеющих один тип связи. Например, липаза расщепляет

сложноэфирную связь между глицерином и любой жирной кислотой в триацилглицеринахПолесГУ.

3.Относительная групповая – фермент катализирует превращение

нескольких субстратов, имеющих один тип связи, но требуются определенные атомные группировки, образующие эту связь. Например,

все протеолитические ферменты ра щепляют пептидную связь, но пепсин – образованную –NH2 группами ароматических аминокислот, химотрипсин – образованную –СООН группами этих же аминокислот, трипсин – пептидную связь, образованную –СООН группой лизина, аргинина.

4.Стереохимическая – фермент катализирует превращение только одного стереоизомера при наличии их смеси. Например, L-оксидаза превращает L-аминокисл ту, но не действует на D-изомер.

одного типа. Часто одно и то же химическое соединение выступает как субстрат для разных ферментов, причем каждый из них, катализируя специфическую для него реакцию, приводит к образованию разных продуктов. Например (реакция 5.1):

Реакция 5.1—декарбоксилирование специфичность к типу реакции лежит в основе единой классификации ферментов.