Бут_акуш_лаб23

Лабораторна робота 23.

ОЦІНКА І ЗБЕРІГАННЯ ЕМБРІОНІВ

1. Яка техніка проведення мікрохірургічного поділу ембріонів?

До поділу допускаються свіжовилучені що зберігалися при 0°С або деконсервіруванні ембріони гарної і відмінної якості на стадії морули, ранньої, що розширюється і розширеної бластоцисти. Перед поділом ембріони пересаджують у краплю 20% розчину ФС у ФСБ на предметному склі і поміщають під мікроскоп.

Поділ проводять скляною голкою в площині симетрії зародка шляхом роздвоєння бластомерів при повільному натисненні голкою на зародки. Нами розроблений спосіб мікрохірургічних операцій на яйцеклітинах і ембріонах (Осташко, Безуглий, Гордиенко, 1990), що відрізняється тим, що з метою підвищення схоронності об'єкта і технологічності операції (виймання ембріонів із прозорої оболонки, пересадження бластомерів, розподіл на частини і т.п.) виконуються в гіпертонічному розчині непроникаючих речовин з концентрацією 1,2...1,5 М в біологічно повноцінному середовищі. При цьому ембріон стискується усередині зони, що полегшує мікроманіпуляції при його поділі. Для пересадження використовують половинки зародка, що поміщають у паєтти відразу після поділу. Більш високий рівень приживлення розділених ембріонів досягається при попередньому розміщенні їх у порожні прозорі оболонки, що заготовлюють заздалегідь.

2. Яка методика глибокого заморожування і тривалого зберігання

ембріонів?

Для криоконсервації ембріонів технологія передбачає використання як традиційного методу заморожування, так і прямого занурення в рідкий азот.

При замерзанні ембріонів у їхній протоплазмі утвориться багато льоду, що може бути причиною або механічного руйнування внутрішньоклітинних органелу і цитоплазматичної мембрани, або осмотичного шоку в результаті кристалізації або рекристалізації внутрішньоклітинної води.

Видалення води з клітин проводиться в діапазоні субнулевих температур. Під час кристалоутворення зростає концентрація позаклітинних розчинів, вода всередині клітки спрямовується з клітки через цитоплазматичну мембрану, що веде до зневоднення бластомерів; при подальшому заморожуванні великі кристали всередині клітин уже не утворюються.

Методи:

• Заморожування ембріонів в повільному режимі

• Кріоконсервація ембріонів шляхом прямого занурення в рідкий азот

3. Охарактеризуйте методику короткострокового зберігання ембріонів.

Короткочасне зберігання ембріонів. Від вимивання ембріонів до пересадки їх реципієнтам проходить звичайно не менше 3 год. Протягом цього часу потрібно зберегти життєздатність ембріонів. Для цього їх можна помістити в 0,5 мл середовища для культиву- вання ембріонів на годинниковому скельці, поставити його в сте- рильну чашку Петрі, дно якої вистелене вологим фільтрувальним папером, накрити і поставити в термостат з температурою 37 °С.

3. Охарактеризуйте методику довготривалого зберігання ембріонів.

Для тривалого зберігання ембріона його засмоктують в пайєту так, щоб з обох боків його утворилися повітряні пухирці довжиною 1 – 1,5 см. Закривають кінці пайєти сталевими кульками або полі- етиленовими корками і вміщують у термостат при 37 °С. Можна зберігати ембріони і під шаром стерильного вазелінового масла на годинниковому склі чи в пробірці. За таких умов біологічно повноцінні ембріони можуть культивуватися протягом 24 – 48 год, хоча цим методом користуються лише як вимушеним заходом. В кінці культивування обов’язково перевіряють під мікроскопом життєздатність ембріонів. Зберігають ембріони також при знижених плюсових температурах, що викликають зворотне гальмування метаболічних процесів.

6. Що таке кріопротектори?

Кріопротектор — речовина, що захищає живі об'єкти від шкідливої дії заморожування. Кріопротектори використовують при кріоконсервації — низькотемпературному зберіганні живих об'єктів.

6. Які є методи кріоконсервування ембріонів?

• Традиційний метод заморожування.

• Занурення в рідкий азот.

Оптимальною стадією для заморожування ембріонів великої рогатої худоби є рання бластоциста, овець і кіз — пізня морула або рання бластоциста, свиней — бластоциста. Краще витримують заморожування свіжі ембріони.

Заморожування ембріонів набагато складніше, ніж заморожування сперми, тому що вони є багатоклітинними утвореннями.

Для того, щоб запобігти кристалізації внутрішньоклітинної води, до складу середовища додають кріопротектори диметилсульфоксид чи гліцерин, а щоб уникнути осмотичних зрушень, штучно стимулюють кристалізацію на певній стадії.

На перших етапах розробки технології насичення (еквілібрації) кріопротектором середовища з ембріоном проводили, поступово пе- реносячи ембріони на годинникових скельцях у чашці Петрі з роз- чину з меншою концентрацією кріопротектора у розчин з вищою його концентрацією (0,25; 0,5; 1,0; 1,5 М ДМСО), витримуючи у кож- ній з них по 5 хв (чи 3,3; 6,6 та 10 %-му гліцерині). Закінчивши «на- сичення» ембріонів кріопротектором, їх розфасовували в пайєтах у такій послідовності: середовище — повітря — середовище з ембріоном — повітря — середовище (рис. 65). Кожен стовпчик має довжину 1 – 2 см. Один край пайєти закривали зволоженим корком, після чого заморожували.

Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін за 3 – 4 с до початку утворення льоду (мінус 6 – 7 ºС) стимулювали кристалізацію, додаючи до розчину зернину льоду, кристалик срібла йодиду чи просто торкаючись переохолодженим предметом (проколюють фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею середовища і швидко торкаються нею поверхні рідини).

Після розморожування ембріонів їх відмивали від кріопротектора, переносячи поступово з розчинів з більшою концентрацією кріопротектора в менш концентровані розчини з часом витримування в кожному розчині ДМСО 5 хв, а в гліцерині — 10 хв.

Нині застосовують простіший (одноступінчастий) метод насичення кріопротектором. Після морфологічної оцінки та відмивання ембріонів від механічних забруднень їх вміщують у 1,4 М розчин гліцерину і витримують 15 – 20 хв. Для приготування розчину до 9 мл одного із середовищ для тканинних культур або Дюльбекко з 0,4 %-м бичачим сироватковим альбуміном додають 1 мл гліцерину. Для запобігання контамінації ембріонів патогенними та умовно пато- генними мікроорганізмами середовище проціджують крізь фільтр типу «Мілекс», «Millipore» з діаметром пор 0,22 мк.

Після витримування ембріонів у 1,4 М розчині гліцерину їх переносять у соломинки (пайєти) в такій послідовності, як зазначено вище.

8. Яке обладнання використовують при кріоконсервуванні ембріонів?

• Пайєти

• фільтр типу «Мілекс», «Millipore»

• чашки петрі

9. Як розморожують ембріони?

Розморожують ембріони, заморожені в пробірках, у водяній бані при температурі 30 – 35 ºС. Заморожені в пайєтах ембріони вийма- ють з посудини Дьюара, витримують 6 – 8 с на повітрі при кімнат- ній температурі, вміщують у водяну баню при температурі 25– 30 ºС на 10 – 15 с до зникнення льоду. Після цього видаляють із пайєти маркерний корок, зрізають ножицями ватний корок і вміст соломин- ки зливають на годинникове скельце.

10. Як оцінити життєздатність статевих клітин та ембріонів після

деконсервування?

Існує декілька підходів до оцінки ембріонів. Греве пропонує оцінювати їх за такими показниками: життєздатні – ембріони, стадія розвитку яких співпадає з їх віком, що відраховується, починаючи з дня осіменіння; сповільнені (ретардовані) – ембріони, які виявляються на дещо ранніх стадіях розвитку, ніж очікувалося в зв’язку з їх віком; вироджені (дегенеровані) – ембріони з різними ознаками дегенерації. Райт класифікує ембріони за морфологічними ознаками на: нормальні; ембріони з незначними відхиленнями; ембріони із збільшеною кількістю дегенерованих клітин. М. І. Сергєєв та Ф. І. Осташко запропонували 5-бальну систему оцінки ембріонів за морфологічними ознаками. Проте на підставі морфологічної оцінки ембріонів важко зробити висновок про їх життєздатність. Все залежить від їх розвитку в процесі культивування і від приживлення їх в розі матки. На жаль, точніших, а головне – доступних для виробництва методів поки що немає. В сумнівних випадках можна залишити вимиті ембріони в невеликій кількості поживного середовища на 30–40 хв. в термостаті для діагностичного культивування.