Бут_акуш_лаб6

Лабораторна робота 6

Тема: “Визначення концентрації сперміїв у спермі плідників сільськогосподарських тварин”.

Хід роботи:

1. Що таке «концентрація» сперміїв у спермі?

Концентрацією сперміїв називається кількість їх в 1 мл сперми, виражена вмільйонах або мільярдах. Концентрацію визначають звичайно способом підрахунку сперміїв у лічильній камері,що застосовується для визначення концентрації форменних елементів крові.

2. Від яких факторів залежить концентрація сперміїв у спермі?

Залежить від багатьох факторів, такі як: вік плідника, індивідуальні особливості, режим годівлі та використання, умови утримання, пора року. Цей показник визначають бо це надає можливість розрахувати кількість спермодоз, у скільки разів можна розріджувати сперму.

3. Які є методи визначення концентрації сперміїв у спермі?

Найбільш точний – в рахувальній камері (наприклад, Горяєва). Інші використовують рідше – визначення на фотоелектроколориметрі а також фотоелектричним гемометром. І застарілий метод - метод оптичних стандартів.

4. В якій послідовності визначають концентрацію сперміїв в рахувальній камері Горяєва?

Спочатку готуємо камеру, потім розбавляємо сперму у меланжері (бо якщо сперма у нативному вигляді – кількість сперміїв неможливо порахувати). Розбавлену сперму заправляємо у камеру, щоб вона повністю заповнила її поверхню. Потім підраховуємо кількість сперміїв у лічильній камері та розраховуємо концентрацією за формулою.

5. Як готують рахувальну камеру до визначення концентрації сперміїв у

спермі?

Камеру та скельця потрібно спочатку промити теплою проточною водою, потім дистильованою і витерти сухою марлевою серветкою. На камеру «притирають» покривне скельце, щоб воно покривало обидві сітки.

6. Як розріджують сперму в змішувачі (меланжері)?

Сперму барана і бугая розріджують у еритроцитарних меланжерах, а сперму жеребця і кнура в лейкоцитарних. Набираєм до мітки 0,5 сперму, а потім до мітки 101 (для еритроцитарного меланжеру), або до мітки 11 (для лейкоцитарного меланжеру) розчин хлориду натрію 3% (гіпертонічний розчин який зробить оболонку сперми більш видимою). Перемішуємо у меланжері. Потім видавлюємо 4-5 крапель сперми на вату (бо вона нерозбавлена), і з 6 краплі можна заряджати у камеру.

7. Як проводять заправку рахувальної камери розрідженою спермою?

Заряджаємо камеру одразу після змішування у меланжері. 6 краплю випускають під покривне скло, що притерте до камери.

8. Як проводять обчислення концентрації сперміїв в досліджуваній спермі?

В 5 великих квадратах, що розташовані по діагоналі, рахуємо спермії (по голівках). Рахуємо ті, які розташовані всередині, і ті, що на лівій та верхній стороні кожного квадрата. Це дозволяє не рахувати повторно одні й ті самі спермії. Рахуємо в обох заправлених сітках. Потім визначаємо концентрацію сперміїв по формулі. У формулі звертаємо увагу на об’єм сітки, варіант камери. Варіант формули:

С = (Н × Д × 400 × 1000) / N p,

або С = (Н × Д × 4000 × 1000) / 80,

де׃

• С – концентрація сперміїв;

• Н – кількість сперміїв у 80 малих квадратах;

• Д – ступінь розрідження сперми у змішувачі (20; 100 чи 200);

• 400 – число для переведення у квадратні міліметри;

• 4000 – число для переведення в кубічні міліметри (об'єм одного малого квадрата становить 1/4000 мм3);

• 1000 – число для переведення в мілілітри (в 1 мл міститься 1000 мм3);

• N– кількість малих квадратів, у яких здійснюють підрахунок;

• р – глибина камери, яка становить 0,1 мм.

9. Який принцип визначення концентрації сперміїв у спермі методом

оптичних стандартів?

Метод застарілий і не дуже точний. Він дозволяє визначити приблизну концентрацію. Під стандартами маються на увазі запаяні скляні пробірки з мутною рідиною, яка за виглядом нагадує сперму певних видів тварин.

Для визначення концентрації цим методом – в чисту пробірку наливають 1,5–2 мл досліджуваної сперми. Пробірки порівнюють із стандартами, дивлячись на світло. Підбирають стандарт, який найбільш близький по мутності до досліджуваної сперми, і вказану на пробірці концентрацію приймають за концентрацію сперми.

10. Як будують криву оптичної щільності при визначенні концентрації

сперміїв у спермі на фотоелектроколориметрі?

Для побудови графіка беруть сперму із концентрацією вище 1 млрд/мл, і роблять розведення з різною концентрацією. Потім на осі абсцис відкладають значення концентрації сперміїв, а на осі ординат – величини оптичної густини, що їм відповідають. Через точки проводять криву. При цьому ця крива має наближатись до прямої.

11. Як визначають концентрацію сперміїв у спермі на фотоелектроколориметрі?

Цей спосіб такий же точний, як і метод із лічильною камерою, але швидший. Суть полягає у тому, що оптична густина сперми пропорційна концентрації у ній сперміїв. Для визначення концентрації будують градуйовану криву – беруть сперму із концентрацією більш, аніж 1 млрд/мл і роблять розведення із різною концентрацією. Тобто, перед проведенням цього методу все одно потрібно порахувати кількість сперміїв іншим методом. Потім розбавляємо градуйовано (1 млрд, 0.9, 0.8 і тд...). 3.5% розчином натрію цитрату. Потім, маючи такий графік – ставимо пробірки у ФЕК, отримуючи оптичну густину і вже по калібрувальному графіку визначаємо концентрацію сперміїв, множачи значення на 10.

12. Як визначають концентрацію сперміїв у спермі фотоелектричним

гемометром?

Принцип аналогічний визначенню на фотоелектроколориметрі, з певними нюансами щодо роботи самого приладу. До включення приладу в електричну мережу рукояткою “установка нуля” переводять стрілку мікроамперметра на нуль. Встановлюють на нуль шкалу відрахувального барабана. Встановлюють в положення Е перемикач виду робіт. Потім встановлюють інфрачервоний фільтр. В гніздо приладу встановлюють кювету з 3,5%-ним розчином натрію лимоннокислого, налитого до позначки. Включають прилад, замінюють кювету з 3,5%-ним розчином натрію лимоннокислого на контрольний фільтр Е. Рукоятку відрахувального барабана повертають за годинниковою стрілкою і встановлюють мікроамперметр на нуль. Записують відрахунок по градусній шкалі, при якому стрілка гальванометра стане на нуль. Цей відрахунок буде контролем правильності настройки приладу. Спочатку досліджують 15–20 зразків сперми з відомою концентрацією, дотримуючись нижчепоказаного розрідження. Знаючи їх концентрацію по лічильній камері, будують градуйовану криву і виводять по ній таблицю залежності показань приладу від концентрації сперміїв.

При дослідженні сперми різних тварин роблять різні розрідження. Для бугая 1:200, барана 1:400, кнура 1:30. Потім визначають по градуйованій кривій концентрацію.

Висновок: на лабораторному занятті ми детально ознайомились із методами визначення концентрації сперміїв у спермі.