74. Замораживание спермы. Классификация

В природе существует 2 вида замерзания.

Кристаллическое замерзание, когда молекулы вещества распределяются в пространстве в определенном порядке. Происходит медленно, скачкообразно, со значительными молекулярными перемещениями.

Стекловидное замерзание – молекулы вещества распределены в пространстве хаотично. Происходит быстрее, при этом виде замерзания не отмечено значительных молекулярных перемещений. Биологически менее вредно.

В процессе замерзания сперма претерпевает три последовательных состояния:

1. Жидкое или полужидкое – при температуре около 0С̊;

2. Зона кристаллического замерзания – при температуре -40-60С̊;

3. Зона стекловидного замерзания – при температуре -150-273С̊.

Причинами гибели спермиев при замораживании неразбавленной спермы являются:

• Изменение концентрации солей, так как вода замерзает, а соли выпадают в осадок, и создается гипертоническая среда;

• Переход мелких кристаллов в более крупные.

Для предохранения от гибели применяют глицерин, так как он перетягивает воду, и спермии переносят зону кристаллизации легче.

Замораживание спермы в необлицованных гранулах: для разбавления используют среду ЛГЦЖ. Разбавление осуществляется сразу до нужной концентрации. С помощью специальной установки сперма фасуется в лунки пластины. Объем гранул 0,5 мл или 0,2 мл. Сначала пластина охлаждается в парах жидкого азота, затем погружается в толщу жидкого азота, затем приподнимается, разливается сперма, замораживается (опускают обратно в жидкий азот на 3–4 минуты), поднимается, гранулы собираются в подписанные полиэтиленовые мешочки.

Замораживание спермы в облицованных гранулах. Для разбавления используют среду №1 и №2. Фасовка разбавленной спермы в стерильную тонкостенную полимерную трубу осуществляется через спермоприемник. Он связан с прибором, который производит отсечение гранул (0,25–0,33мл) путем спайки двух поверхностей. Затем осуществляется эквилибрация -процесс медленного охлаждения при температуре +2–+5 и при постоянном вращении барабана с контейнерами (2–10 оборотов в минуту). После этого сперму замораживают в жидком азоте 10мин. В марлевые мешочки на хранение.

Расфасовка спермы в пайетах. Доза спермы расфасовывается в соломинки (0,25–0,3 мл). Затем сперма, раскладывается на металлических рамках и выдерживается 4ч в холодильнике при температуре 4-5°С - процесс эквилибрации. Пайеты в рамке охлаждают парами жидкого азота, затем погружаются в толщу жидкого азота и собираются в пластиковые стаканы для хранения.

75. Разбавление и хранение спермы

Состав искусственных сред для разбавления спермы:

1. Неэлектролиты – углеводы (фруктоза, лактоза, глюкоза). Служат источником E для спермиев

2. Электролиты – (цитрат натрия). Предохраняют от набухания, ослизнения, поддерживают буферные свойства

3. Нейтрализатор температурного шока – желток куриного яйца

4. Антибиотики и сульфаниламиды (полиген)– для сдерживания размножения микрофлоры

5. Эндоцеллюлярный криопротектор – глицерин. Он снижает вероятность образования кристаллов в половых клетках.

В зависимости от состава искусственных сред, их подразделяют на 3 вида

1. Экстендоры. Состоят из 1–2 компонентов. Универсальным является молоко самки соответствующего вида животных.

2. Протекторы. Защитные среды. Состоят из основных компонентов искусственных сред.

3. Имплементоры – протекторы + БАВ. Прежде всего те, которые способствуют активизации сократительной деятельности мышечных структур репродуктивной системы самок (простагландины, окситоцин, вазопрессин), ферменты, участвующие в разжижении течковой слизи (муциназа, каталаза).

Замораживание спермы в виде полипропиленовых соломинок (пайет): ЛГЖ среда

Среды для облицованных гранул:

• среда № 1 - раствор лактозы/сахарозы, полиген, глицерин, желток куриного яйца.

• среда № 2 - лактоза, натрий лимоннокислый, полиген, глицерин, вода дистиллированная.

Синтетическая среда ГЦЖ (вода дистиллированная, глюкоза, цитрат натрия, желток куриного яйца)

ЛГЦЖ (лактозо-глицерино-цитратно-желточная среда) (Ситева рекомендовала эти запомнить)

Хранение спермы бывает:

1. Краткосрочным (1-5суток)

• Понижение t до 2–5 С̊. Замедляется в 10 раз расход энергетических ресурсов, спермии дольше сохраняют подвижность и оплодотв.способность.

• Созданием слабокислой реакции среды

• Внесением в разбавитель хим. ингибиторов метаболических процессов

2. Длительное хранение при t 196С̊ в жидком азоте.

Преимущества длительного хранения спермы при низких отрицательных температурах.

• Неограниченно долгое сохранение спермы

• Позволяет применить метод оценки быков по качеству потомства;

• Высокая эффективность: при глубокой заморозке спермы отход составляет около 5%;

• Легче транспортировать;

• Экономия средств за счет ликвидации малоценных производителей;

• Систематическое использование производителей положительно отражается на их здоровье