Metabolicheskaia_biokhimiia

311

Задание: сделайте вывод о возможности использования метода Бенедикта для определения содержания белка в растворе. В чем преимущества данного метода?

Опыт 2. Биуретовый метод определения содержания белка в растворе.

Из стандартного раствора альбумина (10 мг/мл) готовят в соответствии с таблицей 2 растворы, содержащие 2, 4, 6, 8, 10 мг альбумина в 1 мл.

Объем раствора белка соответствующего разведения во всех пробирках 1 мл. Затем добавляют в каждую пробирку по 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют на 30 мин (22 °С).

Далее замеряют оптическую плотность растворов на СФ в стеклянной или кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540 нм (Е540).

На каждую пробу проводят два определения, для построения калибровочного графика используют среднее арифметическое. Калибровочный график строят по аналогии с опытом 1.

Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику (рисунок 2).

Таблица 2. – Состав проб для определения содержания белка с помощью биуретового реактива

Рисунок 2. – Калибровочный график зависимости оптической плотности (Е) белкового раствора (длина волны 540 нм) от концентрации белка

311

312

Задание: сделайте вывод о возможности использования биуретового метода для определения содержания белка в растворе. В чем преимущества данного метода?

Опыт 3. Спектрофотометрический метод определения содержания белка в растворе.

Для опыта используют стандартный раствор белка. В кварцевую кювету помещают 3 мл раствора белка и измеряют величину оптической плотности раствора на СФ при длине волны 260 и 280 нм. На основании полученных данных содержание белка рассчитывают по формуле Калькара:

Содержание белка=1,45∙А280-0,74∙А260 (мг/мл),

где А280 – оптическая плотности раствора белка при 280 нм, А260 – оптическая плотности раствора белка при 260 нм.

Задание: на основании проведенных опытов сделать вывод о содержании белка в исследуемых растворах, сравнить методы количественного определения белка между собой.

Контрольные вопросы

1.Перечислите методы определения содержания белка в растворе.

2.В чем суть биуретового, микробиуретового, спектрофотометрического методов определения содержания белка в растворе?

3.Какие еще методы определения концентрации белка в растворе Вам известны?

4.На какой реакции основано количественное определение белка биуретовым медом?

5.Значение определения белка в биологических жидкостях (крови,

моче).

Распределительная хроматография аминокислот на бумаге.

Цель: провести идентификацию аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге.

Теоретическая часть

Метод является одним из методов распределительной хроматографии. В роли твердого носителя используют специальную хроматографическую бумагу в виде листов или полосок.

Этот метод широко используется для разделения смеси аминокислот, для качественного обнаружения отдельных аминокислот. Достоинством этого метода является то, что он позволяет исследовать ничтожное количество вещества. Разделение аминокислот основано на их различной растворимости в нескольких несмешивающихся жидкостях (фазах).

Одной из жидкостей служит вода, которая прочно ассоциируется с молекулами целлюлозы и образует неподвижную фазу. Менее полярные водонасыщенные органические растворители (изобутиловый, изопропиловый, бутиловый спирт, фенол и др.) составляют подвижную фазу. Подвижный органический растворитель поднимается по полоске бумаги,

312

313

растворяет нанесенные на бумагу аминокислоты и увлекает их за собой. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от степени их растворимости в подвижных и неподвижных фазах. Чем больше растворимость аминокислот в водной фазе и чем меньше ее растворимость в неводной фазе, тем медленнее движется аминокислота по сравнению с фронтом органического растворителя. Иными словами, аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (Гли, Лей, Иле, Фен, Трп, Вал, Мет, Тир), перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими боковыми цепями (Про, Ала, Гли) или с полярными боковыми цепями (Тре, Глу, Сер, Арг, Асп, Гис, Лиз, Цис).

Положение отдельных аминокислот на хроматографической бумаге обнаруживают при помощи цветной реакции с нингидрином. Идентификацию отдельных аминокислот на хроматограмме проводят путем нанесения на ту же хроматограмму "свидетелей" – растворов отдельных аминокислот. Можно также идентифицировать аминокислоты по величине Rf , равной отношению пути, пройденного аминокислотой (от места нанесения) (а) к расстоянию, пройденному растворителем (от места смеси аминокислот до фронта растворителя) (b): Rf = а/b.

Коэффициент Rf – величина, характерная для каждой аминокислоты и постоянная при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги). Возможны разные варианты хроматографии на бумаге: нисходящая, восходящая, радиальная.

Практическая часть

1.Квадрат хроматографической бумаги размером 11×11 см делят диагоналями на 4 части. В центре пересечения диагоналей описывается окружность радиусом 10 мм, стороны квадрата нумеруют. На середину каждой их четырех дуг, ограниченных диагоналями, наносят микропипеткой пятнышко (2-3 мм в диаметре) из аминокислот "свидетелей" и анализируемую смесь аминокислот.

2.В центре квадрата иглой проделывают отверстие и в него вставляют фитиль, скатанный из небольшого треугольника фильтровальной бумаги в виде трубочки.

3.На дно чашки Петри наливают 10–15 мл смеси растворителей (бутанол, уксусная кислота, вода) так, чтобы было покрыто дно чашки. Квадрат помещают на чашку Петри так, чтобы он лежал на ее краях. Фитилек должен касаться дна чашки Петри. Чашку Петри накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре.

По фитильку растворитель поднимается вверх, распределяется по бумаге от центра к периферии листа. Когда фронт растворителя дойдет до краев чашки Петри (примерно через 1 час), хроматограмму снимают,

отмечают карандашом фронт растворителя, помещают ее на крышку чашки Петри и ставят в сушильный шкаф при температуре 100 – 130 0С на 5 минут (до исчезновения запаха растворителя). Высушенную хроматограмму проявляют 0,2% раствором нингидрина в ацетоне и вновь помещают в сушильный шкаф. Через несколько минут на хроматограмме появляются

313

314

пятна, указывающие положение аминокислот.

4.Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент распределения Rf. Аминокислоты анализируемой смеси идентифицируют, сравнивая их с Rf аминокислоты – "свидетеля".

Оформление работы. В лабораторную тетрадь записывают принцип метода бумажной хроматографии. Полученную хроматограмму вклеивают в тетрадь (или зарисовывают). После расчета аминокислот смеси и "свидетелей" на хроматограмму наносят названия аминокислот смеси.7

Контрольные вопросы

1.В чем суть бумажной хроматографии? Где её применяют?

2.Перечислите виды бумажной хроматографии и кратко опишите каждый из них.

3.В чем суть метода ионообменной хроматографии?

4.В чем суть метода аффинной хроматографии?

5.Какие методы разделения индивидуальных белков вам известны?

Раздел 4 Обмен углеводов

Тема Расщепления олиго- и полисахаридов. Гликолиз и гликогенолиз

Лабораторная работа №3. Ферментативное расщепление олиго- и полисахаридов

Цель: осуществить в лабораторных условиях кислотный и ферментативный гидролиз углеводов.

Опыт 1. Кислотный гидролиз полисахаридов

Поместите в одну пробирку кусочек фильтровальной бумаги (0,5–1 см), добавьте 3–5 капель концентрированной серной кислоты. В другую пробирку налейте 1 каплю крахмального клейстера, 2 капли раствора серной кислоты. Затем осторожно подогрейте смесь в пробирках на кипящей водяной бане, периодически встряхивая до полного растворения в течении 20 мин. Добавьте в обе пробирки по 10 капель гидроксида натрия для нейтрализации кислоты и создания щелочной среды и по 1 капле сульфата меди. Что при этом происходит?

Нагрейте верхнюю часть раствора в пробирках до кипения. Объясните происходящие изменения.

Для сравнения подействуйте реактивом Фелинга на негидролизованные полисахариды.

Задание: 1. Напишите уравнения реакций гидролиза крахмала и клетчатки с образованием промежуточных продуктов.

2. О чем свидетельствует появление осадков при нагревании растворов? Напишите соответствующие уравнения.

Опыт 2. Ферментативный гидролиз крахмала

Ферментативный гидролиз крахмала проводят в присутствии фермента

314

315

амилазы. α-амилаза катализирует гидролиз α(1→4)- гликозидных связей крахмала, в результате чего увеличивается число свободных гликозидных гидроксильных групп, проявляющих восстанавливающие свойства, что можно проследить с помощью реакции Троммера или реакции Фелинга.

Гидролиз крахмала ферментом α-амилаза.

Последовательность стадий расщепления крахмала: КРАХМАЛ

↓

АМИЛОДЕКСТРИНЫ (фиолетово-синее окрашивание в присутствии раствора Люголя)

↓

ЭРИТРОДЕКСТРИНЫ (буровато-красное окрашивание в присутствии раствора Люголя)

↓

АХРОДЕКСТРИНЫ (желтое или буровато-желтое окрашивание в присутствии раствора

Люголя)

↓

МАЛЬТОДЕКСТРИНЫ (не дают окрашивания в присутствии раствора Люголя)

↓

МАЛЬТОЗА (не дает окрашивания в присутствии раствора Люголя)

↓

ГЛЮКОЗА Выполнение. На предметное стекло, под которое подложен лист белой

бумаги, наносят 2 ряда из 6 отдельных капель раствора Люголя. В одну пробирку наливают 3 мл 0,5 % раствора крахмала и 1 мл препарата амилазы, в другую – 3 мл раствора крахмала. Обе пробирки помещают в водяную баню (термостат), предварительно прогретую до 37 ºС. Каждые 2 мин берут глазными пипетками из каждой пробирки каплю жидкости и наносят ее на каплю раствора Люголя.

Сначала синее окрашивание будет проявляться при добавлении капель, взятых из обеих пробирок, затем только при добавлении капель из пробирки без амилазы. Капля содержимого из пробирки, в которой протекает ферментативный гидролиз, будет окрашиваться раствором Люголя в краснобурый цвет, затем в желтый и, наконец, перестанет давать окрашивание.

Наблюдают также наличие опалесценции в контрольной пробирке (без амилазы) и ее отсутствие в пробирке, содержащей фермент.

Задание: объясните наблюдения.

Опыт 3. Влияние температуры на активность амилазы

Препарат амилазы (1 таблетку коммерческого препарата―Мезим растолочь в ступке пестиком и растворить в 100 мл дистиллированной воды). Выполнение. В четыре пронумерованные пробирки вносят по 4 мл раствора крахмала и по 1 мл препарата амилазы. Первую пробирку быстро помещают

315

316

в кипящую водяную баню, вторую – в лед, третью – в термостат при 37 °С, четвертую оставляют при комнатной температуре.

Через 10 мин содержимое каждой пробирки разделяют на две приблизительно равные части.

С одной частью проводят пробу на крахмал: добавляют 2 капли раствора Люголя – синее окрашивание свидетельствует о наличии негидролизованного крахмала. С другой частью проводят реакцию Троммера. Появление желтого окрашивания, переходящего в кирпичнокрасное, свидетельствует о наличии восстанавливающих углеводов (глюкозы), появившихся после полного расщепления крахмала.

Задание: объясните наблюдения.

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы Выполнение. Берут три пронумерованные пробирки. В первую

наливают 10 капель дистиллированной воды, во вторую – 8 капель воды и 2 капли раствора NaCl, в третью – 8 капель воды и 2 капли раствора CuSO4. В каждую пробирку добавляют по 10 капель препарата амилазы, тщательно перемешивают. Затем во все пробирки добавляют по 5 капель раствора крахмала, вновь перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора Люголя.

Анализируют результаты: активатором амилазы является раствор NaCl (2-я пробирка), ингибитором (3-я пробирка).

Задание: объясните наблюдения.

Контрольные вопросы

1. Роль углеводов для организма.

2. Углеводы растений, их роль.

3. Пути мобилизации полисахаридов в организме животных, растений и микроорганизмов.

4. Какие ферменты осуществляют мобилизацию крахмала и гликогена? 5. Действие амилаз на сырой и вареный крахмал.

6. Методы контроля (определения) активности амилаз.

7. Результаты определения скорости гидролиза сырого и вареного крахмала амилазами солода.

8.Биологическое окисление и его роль.

9.Стадии окисления глюкозы в клетках, место их локализации.

10.Характеристика анаэробной стадии окисления глюкозы.

11.Роль брожения в живой природе.

316

317

ВОПРОСЫ К ЭКЗАМЕНУ

Примерный перечень вопросов к экзамену по дисциплине «Метаболическая биохимия» для подготовки студентов

специальности 1-31 01 02 Биохимия

1.Общая характеристика метаболизма. Метаболические пути и метаболиты. Центральные и амфиболические метаболические пути. Основные этапы метаболизма биополимеров и макромолекул.

2.Ферментативное расщепление олиго- и полисахаридов в желудочно­кишечном тракте. Внутриклеточное расщепление гликогена.

3.Дихотомический пути расщепления глюкозы в аэробных условиях (опишите химизм процесса). Ключевые метаболиты, регуляция процесса. Биологическая роль гликолиза.

4.Гликогенолиз. Регуляция гликогенолиза. Энергетическая характеристика и биологическая роль этого процесса.

5.Катаболизм углеводов в анаэробных условиях. Брожение.

6.Глюконеогенез, его биологическая роль. Обходные реакции глюконеогенеза (химизм). Цикл Кори.

7.Гликогеногенез. Особенности обмена гликогена в мышцах и печени.

8.Пентозофосфатный путь обмена углеводов, его биологическая роль. Окислительная и неокислительная стадии пентозофосфатного пути.

9.Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Структурная организация и локализация мультиферментного пируватдегидрогеназного комплекса. Регуляция процесса.

10.Амфиболический цикл трикарбоновых кислот. Локализация цикла, ключевые метаболиты и баланс энергии в ЦТК.

11.Химизм реакций цикла трикарбоновых кислот. Необратимые реакции цикла. Субстратное фосфорилирование в ходе цикла. Регуляция цикла.

12.Обмен пировиноградной кислоты в анаэробных и аэробных условиях. Энергетическая характеристика процессов.

13.Энергетическая характеристика полного аэробного окисления глюкозы и окисления глюкозы в анаэробных условиях. Эффект Пастера.

14.Биологическое окисление. Окисление органических соединений, сопряженное с фосфорилированием. Субстратное фосфорилирование.

15.Локализация и структурная организация дыхательной цепи митохондрий. Ступенчатый транспорт электронов от субстратов окисления кислороду.

317

318

16.Участки сопряжения в дыхательной цепи. Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи.

17.Роль пиридинзависимых дегидрогеназ в процессах дыхания. Функциональные особенности НАД и НАДФ (напишите формулы важнейших коферментов).

18.Роль флавинзависимых оксидоредуктаз в процессе дыхания и детоксикации ксенобиотиком. Функциональные особенности ФАД и ФМН (напишите формулы кофакторов).

19.Свободное окисление. Ферменты, катализирующие реакции включения кислорода в молекулу субстрата. Монооксигеназная система цитохрома Р450 и ее роль в детоксикации ксенобиотиков.

20.Активные формы кислорода. Пути их образования. Перекисное окисление липидов (ПОЛ).

21.Перекисное окисление липидов (ПОЛ). Пути ингибирования ПОЛ. Антиоксидантная система организма. Антиоксиданты.

22.Ферментативное расщепление белков в желудочно-кишечном тракте. Активация пищеварительных протеолитических ферментов. Ограниченный протеолиз.

23.Внутриклеточный протеолиз. Убиквитинирование белков.

24.Основные пути катаболизма аминокислот. Декарбоксилирование аминокислот. Физиологическая роль продуктов этого процесса.

25.Основные пути катаболизма аминокислот. Пути образования аммиака. Механизм окислительного дезаминирования.

26.Основные пути катаболизма аминокислот. Механизм и биологическое значение переаминирования.

27. Механизм реакции переаминирования. Напишите уравнения реакций переаминирования α-кетоглутаровой кислоты с аланином и аспарагиновой кислотой.

28.Роль производных витамина В6 в метаболизме аминокислот. Напишите в общем виде уравнение реакции переаминирования.

29.Обезвреживание аммиака в организме. Синтез амидов дикарбоновых аминокислот. Их роль в обмене веществ.

30.Типы азотистого обмена у животных. Синтез мочевины (химизм и локализация процесса).

31.Орнитиновый цикл мочевинообразования. Биологическая роль синтеза мочевины.

32.Заменимые и незаменимые аминокислоты. Основные пути образования аминокислот.

318

319

33.Биосинтез белка. Активация аминокислот. Этапы и механизм трансляции.

34.Энергетическая характеристика процесса трансляции. Посттрансляционная модификация белка.

35.Расщепление липидов в желудочно-кишечном тракте. Эмульгирование жиров. Ресинтез ацилглицеринов в тонком кишечнике. Особенности внутриклеточного липолиза.

36.Р-окисление жирных кислот. Локализация и химизм этого процесса. Энергетический баланс этого процесса. а- и β-окисление жирных кислот.

37.Напишите процесс окисления стеариновой кислоты до СО2 и Н2О. Подведите энергетический баланс этого процесса.

38.Взаимосвязь между Р-окислением жирных кислот и циклом Кребса. Химизм и локализация процесса Р-окислением жирных кислот. Особенности окисления ненасыщенных жирных кислот и жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов.

39.Синтез жирных кислот. Химизм и локализация этого процесса. Мультиферментный комплекс синтаза жирных кислот.

40.Механизмы поступления ацетил-КоА в цитоплазму для синтеза жирных кислот. Напишите общее уравнение процесса синтеза пальмитиновой кислоты. Синтез ненасыщенных жирных кислот и удлинение углеродной цепи.

41.Докажите на конкретном примере (напишите уравнения реакций), что последовательность реакций синтеза жирных кислот приводит к поэтапному удлинению ацилов на два углеродных атома.

42.Регуляция липидного обмена. Взаимосвязь метаболизма жирных кислот и обмена углеводов.

43.Биосинтез триацилглицеринов и глицерофосфолипидов. Роль фосфатидной кислоты в этих процессах.

44.Роль Коэнзима А в метаболизме углеводов и липидов. Структурные особенности Коэнзима А.

45.Ферментативное расщепление нуклеиновых кислот. Разнообразие и специфичность действия нуклеаз. Рестриктазы. Ферментативное расщепление нуклеотидов и нуклеозидов.

46.Катаболизма пуриновых и пиримидиновых оснований. Продукты катаболизма азотистых оснований.

47.Биосинтез пуриновых и пиримидиновых рибонуклеотидов. Роль фосфорибозильного компонента. Образование дезоксирибонуклеотидов.

319

320

48.Биосинтез РНК. Этапы процесса транскрипции. Посттранскрипционная модификация мРНК. Биологическая роль транскрипции.

49.Репликация ДНК. Механизм репликации. Биологическая роль репликации.

50.Взаимосвязь процессов метаболизма углеводов, липидов и белков. Пути регуляции метаболических процессов.

51.Гормональная регуляция активности ключевых ферментов с участием вторичных посредников. Роль внутриклеточных посредников в проведении и усилении гормонального сигнала.

52.Релизинг-факторы гипоталамуса: химическая природа и биохимические функции. Механизм действия гормонов гипоталамуса.

53.Гормоны гипофиза: химическая природа и биохимические функции. Механизм действия гипофизарных гормонов.

54.Тиреоидные гормоны: химическая природа и биохимические функции. Разнообразие и механизм действия гормонов щитовидной железы.

55.Гормоны поджелудочной железы: химическая природа, биохимические функции и механизм действия.

56.Катехоламины: химическая природа, биохимические функции и механизм действия.

57.Гормоны – производные аминокислот: разнообразие и представители. Особенности механизма действия.

58.Стероидные гормоны: разнообразие и биохимические функции. Особенности механизма действия стероидных гормонов.

59.Цитозольный механизм действия гормонов.

60.Мембранно-опосредованный механизм действия гормонов.

320