Metabolicheskaia_biokhimiia

131

1.Фосфорилирование глюкозы осуществляется ферментами: неспецифической гексокиназой с низкой константой Михаэлиса (10-5 М), и

присутствующей преимущественно в печени специфической глюкокиназой (Кm = 10-3 М). Активность глюкокиназы индуцируется глюкозой пищи. Оптимальная концентрация глюкозы крови для глюкокиназы 5 ммоль/л. Реакция фосфорилирования глюкозы необратима. Оба фермента фосфорилируют глюкозу с помощью Mg-АТФ комплекса. Глюкозо-6-фосфат

не проходит через клеточные мембраны и является ключевой молекулой

различных внутриклеточных путей обмена углеводов – гликолиза, гликогенолиза, глюконеогенеза и пентозофосфатного пути.

2.Изомеризация Г-6-Ф во фруктозо-6-фосфат катализируется

фосфогексоизомеразой. Реакция обратима. Изомеризуется только -аномер Г-6-Ф. Это один из наиболее активных ферментов гликолиза.

3.Фосфорилирование Ф-6-Ф во Ф-1,6-БФ, фермент фосфофруктокиназа (ФФК-I). Реакция требует АТФ и Mg2+. Это самая медленная реакция специфического пути катаболизма глюкозы и поэтому

лимитирует скорость всего процесса. Реакция необратима. ФФК -

аллостерический регуляторный фермент.

4.Расщепление Ф-1,6-БФ на две фосфотриозы катализируется ферментом фруктозобисфосфат-альдолазой. В реакции образуются глицеральдегид-3-фосфат (ГАФ) и диоксиацетонфосфат (ДАФ).

5.Изомеризация триозофосфатизомеразой. Равновесие сдвинуто в сторону ДАФ (95%) и 5% ГАФ. Однако в последующие реакции вступает только ГАФ. Итак, 1 молекула гексозы распалась на 2 молекулы фосфотриоз, которые далее превращаются одинаково.

6.Окисление ГАФ. Обе молекулы ГАФ дегидрируются с одновременным присоединением неорганического фосфата с помощью фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФ-ДГ) в 1,3- бисфосфоглицериновую кислоту. Фермент состоит из 4-х субъединиц. В

активном центре фермента находится SH-группа (цис-149) и связанный кофермент НАД+.

В фосфоенолпирувате убрать –ОН.В начале ГАФ присоединяется к ферменту по SH-группе с образованием тиополуацеталя. При его окислении (дегидрировании) образуется богатый энергией тиоэфир. Затем протоны и электроны переносятся от связанного с ферментом НАД на цитоплазматический, а присоединяющийся Рн ведет к образованию 1,3- бисфосфоглицериновой кислоты. Таким образом альдегид окисляется в кислоту, а энергия окисления аккумулируется в виде ~ Р (макроэргического фосфата). Существует обязательный порядок связывания с ферментом

субстратов и отделения от него продуктов реакции: 2 ГАФ + 2 Н3РО4 + 2 НАД+ 2 1,3-БФГК + 2 НАДН+Н+.

7.Фермент фосфоглицераткиназа обеспечивает субстратное фосфорилирование АДФ с образованием АТФ.

8.Перенос фосфата в положение С2 катализируется

фосфоглицератмутазой. В качестве «косубстрата» участвует 2,3-

131

132

бисфосфоглицерат и необходимы ионы Мg2+. В большинстве тканей содержание 2,3-бисфосфоглицерата незначительное, но в эритроцитах количество этого вещества достигает 4 мМ. Это связано с участием 2,3- бисфосфоглицерата в транспорте кислорода гемоглобином, он снижает сродство гемоглобина к кислороду.

9.Енолизация. Фермент енолаза. Требует обязательного присутствия ионов Мg2+, Мn2+. Енолаза блокируется флюоридом. Это используется для сохранения глюкозы в консервированной крови.

При енолизации происходит образование макроэргической связи (61,9 кДж/моль) в составе фосфоенолпирувата (ФЕП).

10.Фермент пируваткиназа обеспечивает субстратное фосфорилирование АДФ с образованием АТФ.

Таблица 5. – Изменения свободной энергии Гиббса в гликолизе при стандартных ( Gº´) и реальных внутриклеточных ( Gº) условиях (D.R.

Appling, S.J. Anthony-Cahill, C.K. Mathews)

Первые 5 реакций относятся к фазе потребления энергии (реакции 1 и 3), вторые 5 реакций – к фазе продукции энергии (реакции 7 и 10). Как в стандартных условиях, так и в живых клетках гликолиз представляет собой необратимый процесс, идущий практически до конца из-за большой отрицательной величины свободной энергии Гиббса. Однако при гликолизе высвобождается небольшая часть всей энергии, заключенной в молекуле глюкозы – примерно 7%. Итогом 10 реакций специфического пути катаболизма глюкозы в цитозоле клеток является: 2 молекулы пирувата; 2 молекулы НАДН+Н+; 4 молекулы АТФ образовалось, но израсходовано 2 молекулы АТФ (+2 молекулы АТФ).

Большинство реакций гликолиза является обратимыми. Три реакции, катализируемые ферментами гексокиназой (глюкокиназой),

фосфофруктокиназой и пируваткиназой необратимы. На этих этапах осуществляется регуляция гликолиза.

132

133

Регуляция гликолиза связана с балансом образования и использования энергии (АТФ).

1.Первый фермент гликолиза – гексокиназа ингибируется продуктом реакции (глюкозо-6-фосфат). Высокая внутриклеточная концентрация глюкозо-6-фосфата сигнализирует о том, что не требуется поступление глюкозы в клетку для получения энергии или запасания в виде гликогена. Ингибирование фосфофруктокиназы ведет к повышению концентрации фруктозо-6-фосфата, а, следовательно, и глюкозо-6-фосфата и ингибированию гексокиназы. Для контроля уровня гликемии в печени имеется специальный изофермент гексокиназы – глюкокиназа. Поскольку фермент имеет в 50 раз меньшее сродство к глюкозе, он функционирует при синтезе гликогена или жирных кислот из избытка глюкозы. Низкая аффинность глюкокиназы печени к глюкозе позволяет обеспечивать мышцы

имозг энергией при низких концентрациях глюкозы в крови.

2.Высокий уровень АТФ аллостерически ингибирует активность

фосфофруктокиназы в печени (тетрамер с молекулярной массой 340 кДа), уменьшая его сродство к фруктозо-6-фосфату. Высокая концентрация АТФ превращает гиперболическую кривую связывания фруктозо-6-фосфата в сигмоидную. Этот эффект АТФ оказывает, связываясь с молекулой фермента вне зоны активного центра.

3.АМФ отменяет ингибиторный эффект АТФ и активность фосфофруктокиназы повышается, если отношение АТФ/АМФ уменьшается. Иными словами, гликолиз активируется при уменьшении энергетического заряда клетки. Почему АМФ, а не АДФ, является положительным регулятором фосфофруктокиназы? Если АТФ утилизируется быстро, имеется возможность поддержания ее концентрации с помощью аденилаткиназы, катализирующей реакцию образования АТФ и АМФ из двух молекул АДФ. Следовательно, АМФ является своеобразной информацией о гипоэнергетическом состоянии. Однако этот регулятор требует специального контроля. Содержание адениловых нуклеотидов [АТФ]+[АДФ]+[АМФ] в клетке относительно постоянно. Концентрация АТФ выше концентрации АДФ, а концентрация АДФ больше концентрации АМФ. Поэтому небольшие изменения [АТФ] сопровождаются большими изменениями в концентрации АМФ, что и позволяет АМФ быть аллостерическим регулятором фосфофруктокиназы.

4.Снижение величины рН также ингибирует активность фосфофруктокиназы. Инибирование фермента протонами предупреждает избыточное образование молочной кислоты и развитие ацидоза.

5.Фосфофруктокиназа ингибируется цитратом, первым метаболитом цикла трикарбоновых кислот.

6.В 1980 году был открыт новый регулятор активности фосфофруктокиназы - фруктозо-2,6-бисфосфат. Фруктозо-2,6-бисфосфат активирует фосфофруктокиназу путем повышения ее сродства к фруктозо- 6-фосфату и уменьшения ингибиторного эффекта АТФ, на рисунке 27.

133

134

Рисунок 27. – Фруктозо-2,6-бисфосфат

Фруктозо-6-фосфат является аллостерическим активатором мультимерного фермента фосфофруктокиназы, обеспечивая переход от Т- состояния в R-состояние.

Внутриклеточную концентрацию фруктозо-2,6-бисфосфата определяют два фермента: синтез определяет фосфофруктокиназа-2, а распад – фруктозо- 2,6-бисфосфатаза. Обе активности присутствуют в одной полипептидной цепи (бифункциональный фермент) с молекулярной массой 55 кДа в виде двух доменов: киназный с N-конца и фосфатазный с С-конца полипептидной цепи. Бифункциональный фермент представлен 5 изоформами, в том числе в печени – L-изоформа и М-изоформа в мышцах. L-изоформа служит для сохранения гомеостаза глюкозы в кровеносном русле. В печени концентрация фруктозо-6-фосфата повышается при гипергликемии, а избыток фруктозо-6-фосфата ускоряет синтез фруктозо-2,6-бисфосфата, который активирует фосфофруктокиназу (активация предшественником).

Активирование-инактивирование бифункционального фермента осуществляется фосфорилированием-дефосфорилированием остатка серина полипептидной цепи. Если содержание глюкозы в крови низкое, выделяется в кровь гормон глюкагон, который посредством аденилатциклазного каскадного механизма обеспечивает фосфорилирование бифункционального фермента с помощью активной протеинкиназы А. Эта ковалентная модификация через активацию фруктозо-2,6-бисфосфатазы и ингибирование фосфофруктокиназы-2 ведет к снижению концентрации фруктозо-2,6-бисфосфата. И, наоборот, при гипергликемии бифункциональный фермент дефосфорилируется, что через активацию фосфофруктокиназы-2 и ингибирование фруктозо-2,6-бисфосфатазы ведет к повышению концентрации фруктозо-2,6-бисфосфата и активации гликолиза.

7. Пируваткиназа контролирует поток метаболитов из гликолиза. Имеется несколько изоферментов пируваткиназы (тетрамерный белок с субъединицами молекулярной массой по 57 кДа): L-тип характерен для печени, а М-тип – для мышц и мозга. Фруктозо-1,6-бисфосфат активирует оба изофермента пируваткиназы, а АТФ и аланин – ингибируют их.

Метаболизм глюкозы в аэробных и анаэробных условиях

Аэробный распад глюкозы является основным путем катаболизма глюкозы у человека и включает следующие процессы:

1) распад глюкозы до пирувата (гликолиз или специфический путь

134

135

распада глюкозы);

2)перенос пирувата в митохондрии и окислительное декарбоксилирование с образованием ацетил-КоА;

3)окисление ацетильной группы ацетил-КоА в ЦТК и сопряженных

цепях переноса электронов до СО2 и Н2О.

На стадии окисления глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-

бисфосфоглицериновую кислоту образуется восстановленный цитозольный НАДН+Н+. Перенос восстановительных эквивалентов от НАДН+Н+ в митохондрии происходит с помощью малатного челночного механизма, на рисунке 28.

Рисунок 28. – Малатный челночный механизм (часть малат-аспартатного челночного механизма)

Молекула восстановленного НАД не может проникать в митохондрии. Поэтому от цитозольного НАДН+Н+ восстановительные эквиваленты сначала при участии малатдегидрогеназы переносятся на цитозольный оксалоацетат. В результате образуется малат, который с помощью переносчиков проходит через внутреннюю мембрану митохондрии в матрикс. Здесь малат окисляется в оксалоацетат, а матриксный НАД+ восстанавливается в НАДН+Н+, который передает электроны в ЦПЭ внутренней мембраны митохондрий. В результате окислительного фосфорилирования образуется 2,5 молекулы АТФ. Оксалоацетат выйти из митохондрий не может, поэтому он вначале превращается в аспартат, который транспортируется переносчиком в цитозоль. Здесь аспартат дезаминируется, превращаясь в оксалоацетат и челночный цикл замыкается. Часто его называют малат-аспартатный челночный цикл. Результатом этого

цикла является окисление цитоплазматического НАДН митохондриальным НАД+.

В некоторых тканях функционирует глицерофосфатный челночный

135

136

механизм. В цитозоле электроны от НАДН передаются на диоксиацетонфосфат с образованием глицерол-3-фосфата; реакцию катализирует глицерол-3-фосфатдегидрогеназа. Глицерол-3-фосфат достигает внутренней мембраны митохондрий, где встроенная в мембрану глицерол-3-фосфатдегидрогеназа с простетической группой ФАД передает электроны от глицерол-3-фосфата в митохондриальную цепь переноса электронов. Образующийся при этом диоксиацетонфосфат возвращается в цитозоль, замыкая тем самым челночный цикл. Следует заметить, что в этом цикле переносчик электронов глицерол-3-фосфат не проникает в матрикс митохондрий, а лишь передает электроны с цитоплазматического НАДН через ФАД→ФАДН2 на цепь переноса электронов.

Тема 4.2 Катаболизм пировиноградной кислоты. Цикл трикарбоновых кислот

4.2.1 Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты

Пировиноградная кислота связывает гликолиз с циклом трикарбоновых кислот. Пируват переносится из цитозоля в матрикс митохондрий с помощью переносчика по механизму симпорта с протоном. В матриксе митохондрий пируват превращается в ацетил-КоА. Этот процесс называется

окислительное декарбоксилирование пирувата и катализируется пируватдегидрогеназным комплексом (пируватдегидрогеназной системой).

Этот ферментативный комплекс был выделен и исследован Л. Ридом. Высокая концентрация пируватдегидрогеназного комплекса обнаружена в сердечной мышце и почках.

Пируватдегидрогеназный комплекс является классическим мультиферментным комплексом, в котором промежуточные продукты остаются связанными на поверхности молекулы фермента до образования конечного продукта. В состав пируватдегидрогеназного комплекса входит 3 фермента и 5 небелковых факторов.

Первый фермент (Е1) – пируватдегидрогеназа содержит тиаминпирофосфат (производное витамина В1); второй фермент (Е2) –

дигидролипоилтрансацетилаза содержит липоевую кислоту (ЛК, 6,8-

дитиооктановая кислота) и кофермент А (НS-КоА), причем остаток липоевой кислоты присоединен к апоферменту путем образования амидной связи между карбоксильной группой ЛК и ε-аминогруппой лизина белка (образуется длинная «рука», состоящая из 13 атомов углерода); третий фермент (Е3) - дигидролипоилдегидрогеназа содержит ФАД и НАД+.

Формулы тиаминпирофосфата, КоА и липоевой кислоты представлены на рисунке 29.

136

Механизм окислительного декарбоксилирования пирувата включает три этапа превращений.

I этап. Пируват взаимодействует с простетической группой пируватдегидрогеназы тиаминпирофосфатом. Основную роль играет второй углеродный атом тиазольного кольца ТПФ, который легко теряет протон, превращаясь в карбанион. Карбанион атакует частично положительно заряженный α-углеродный атом пирувата с возникновением связи С−С. Сильно электрофильный атом азота в карбоксиэтил-ТПФ способствует его декарбоксилированию с образованием гидроксиэтил-ТПФ, на рисунке 30.

137

138

Рисунок 30. – Окислительное декарбоксилирование пирувата

II этап. В следующей реакции, катализируемой дигидролипоилтрансацетилазой, гидроксиэтил-ТПФ взаимодействует с липоевой кислотой. Происходит перенос гидроксиэтильной группы на один из атомов серы ЛК. При этом гидроксиэтильная группа окисляется в ацетильную группу. В процессе окисления гидроксиэтильной группы и восстановления SH-группы ЛК возникает макроэргическая связь. Затем ацетильный остаток переносится на второй кофермент дигидролипоилтрансацетилазы – HS-KoA, а ЛК полностью восстанавливается. Образованный ацетил-КоА отделяется от полиферментного комплекса.

III этап. Восстановленная форма ЛК окисляется дигидролипоилдегидрогеназой.

138

139

Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса

Превращение пирувата в ацетил-КоА – процесс необратимый. Поэтому синтез глюкозы из ацетил-КоА невозможен. Обычно ацетил-КоА далее превращается 2-мя путями: 1) ацетильная группа ацетил-КоА окисляется до СО2 и Н2О через ЦТК и сопряженные цепи переноса электронов с выделением и запасанием энергии в виде АТФ; 2) используется для синтеза кетоновых тел, холестерола и жирных кислот.

Пируватдегидрогеназный комплекс регулируется методом фосфорилирования-дефосфорилирования. Повышение величин отношений НАДН/НАД+, ацетил-КоА/КоА или АТФ/АДФ способствует

фосфорилированию фермента протеинкиназой и дезактивации комплекса.

Пируватдегидрогеназный комплекс инактивируется, если клетка богата энергией и биосинтетическими предшественниками.

Пируват и АДФ, наоборот, активируют пируватдегидрогеназный комплекс посредством ингибирования протеинкиназы.

Вазопрессин активирует пируватдегидрогеназный комплекс путем повышения концентрации ионов кальция в митохондриях, которые активируют протеинфосфатазу (дефосфорилирование фермента). Инсулин также усиливает превращение пирувата в ацетил-КоА через дефосфорилирование пируватдегидрогеназного комплекса. При

недостаточности протеинфосфатазы глюкоза превращается до пирувата, а

дальнейшие превращения пирувата в ацетил-КоА резко ослаблены, так как пируватдегидрогеназный комплекс фосфорилирован, т.е. не активен. Поэтому пировиноградная кислота преимущественно превращается в молочную кислоту. Это приводит к повторяющемуся лактатному ацидозу (подъемы концентрации молочной кислоты в крови), что повреждает многие ткани и особенно центральную нервную систему.

4.2.2 Цикл трикарбоновых кислот

Вторым компонентом общего пути катаболизма является цикл трикарбоновых кислот (ЦТК). Этот цикл был открыт в 1937 г. Г. Кребсом. В 1948 г. Э. Кеннеди и А. Ленинджер доказали, что ферменты ЦТК локализованы в матриксе митохондрий. В 1953 году Г. Кребс получил Нобелевскую премию за открытие ЦТК совместно с Ф. Липманом, открывшего КоА, который в форме ацетил-КоА «сгорает» в ЦТК.

Химизм цикла трикарбоновых кислот. Свободную уксусную кислоту невозможно окислить путем дегидрирования. Поэтому она в активной форме (ацетил-КоА) предварительно связывается с оксалоацетатом (ЩУК, щавелевоуксусной кислотой) и образуется цитрат (рисунок 31).

1. Ацетил-КоА соединяется с оксалоацетатом в реакции альдольной конденсации, катализируемой цитратсинтазой. Образуется цитрил-КоА. Цитрил-КоА при участии воды гидролизуется до цитрата и НS-КоА. Гидролиз этого высокоэнергетичного тиоэфирного промежуточного соединения делает всю реакцию весьма экзергоничной ( G0 = -32,2 кДж/моль).

139