ПолесГУ Аналитическая биохимия и биоинформатика 23-БХ-1 / Vvedenie_v_spetsial'nost'

11

исследованных видов животных, существенно различаются. Именно по этой причине новые лекарственные препараты, предназначенные для введения человеку, предварительно проходят испытание не на одном животном, а на целом ряде различных лабораторных животных.

Только после тщательного сравнительного анализа полученных результатов клинические испытания можно проводить на человеке. При изучении метаболизма ксенобиотиков удобнее всего вводить их в виде изотопных меток. Экскрецию у мелких лабораторных животных целесообразно изучать с помощью специальной метаболической стеклянной камеры, в которую животное помещают на все время опыта.

Благодаря особой конструкции камеры моча и фекалии собираются отдельно, а выдыхаемый углекислый газ поступает в специальную ловушку. При изучении меченных по углероду соединений в клетку подается воздух, не содержащий углекислого газа, а выдыхаемый углекислый газ поглощается раствором гидроокиси натрия; анализ выдыхаемого углекислого газа, меченного по углероду, позволяет установить степень распада изучаемого соединения.

Для изучения распределения введенного соединения животное спустя некоторое время после инъекции умерщвляют с помощью анестезии. Затем проводят исследования либо трупа животного, либо отдельных органов, которые для этой цели изолируют, выявляют морфологические изменения, происшедшие в них, изучают их составные части.

Для получения наглядного представления о распределении введенных мелким лабораторным животным радиоактивных соединений успешно применяется метод авторадиографии препаратов целого организма. Этот метод позволяет получить данные о распределении и относительном содержании введенного соединения в тканях животного, скорости его выведения и способности проникать сквозь биологические мембраны.

Через определенный промежуток времени после введения соединения животное умерщвляют с помощью анестезии и быстро замораживают смесью ацетона с твердым СО2 при температуре –78° С или с помощью жидкого азота. Замороженное животное помещают при низкой температуре в водный раствор смолы (аравийская камедь), а после застывания смолы рассекают на соответствующем уровне резцом, или делают секционные срезы с помощью микротома со специальным лезвием из карбида вольфрама.

Полученный срез прикладывают к рентгеновской пленке и оставляют на 1-2 недели при низкой температуре, после чего пленку проявляют. Сопоставляя полученную авторадиограмму с цветным снимком среза, изучают распределение и локализацию введенного животному изотопа в различных его органах и тканях. Исследование на уровне целых организмов не только не нарушает целостности тканей, но позволяет изучать отдельные органы и ткани, оставляя без изменения снабжение их питательными веществами, нервную и гормональную регуляцию.

12

Исследования на уровнях органа, тканей.

Исследования на этом уровне организации проводят методом перфузии изолированных органов. Сущность этого метода заключается в том, что изучаемый орган (печень, почку или сердце) изолируют из организма животного и помещают в специальный термостатируемый прибор. Затем к перфузионной жидкости, которая обычно вводится в орган через артерию, добавляют исследуемое соединение и анализируют жидкость, вытекающую из органа через вену, что позволяет проследить за превращениями введенного соединения.

Перфузионную жидкость можно пропускать через орган однократно или несколько раз, самотеком или с помощью небольшого насоса. Насос применяют тогда, когда перфузионную жидкость пропускают через орган многократно. В отдельных случаях жидкость прогоняют не при постоянном давлении, а импульсами, что позволяет приблизить условия опыта к ситуации in vivo и имитирует процесс перекачивания крови сердцем. Для проведения перфузии не обязательно полностью изолировать орган; ее можно проводить и на органе вскрытого анестезированного животного.

При этом удастся сохранить интактными нервные волокна и часть сосудистой системы. Действие какого-либо соединения на ткань или орган (например, гистамина на мышцу) можно изучать по механической ответной реакции изолированной ткани на данное соединение. Исследуемое соединение добавляют к омывающей ткань жидкости; в ответ на это ткань, закрепленная с одного конца, а другим концом связанная с пером самописца, начинает двигаться, и любое движение ткани постоянно регистрируется.

Данный метод позволяет изучать ответную реакцию изолированных органов на введение очень небольших (порядка нескольких нанограмм) количеств активных соединений. Преимущество изучения на уровне органа, тканей заключается в том, что при этом удается избежать нежелательных эффектов, обусловленных изменением непосредственного тканевого окружения, как это имеет место, например, при фракционировании клеток. Основным недостатком этих методов является отсутствие гормонального и нервного контроля, поэтому при экстраполяции всех полученных результатов к ситуации in vivo следует соблюдать осторожность.

Исследования на уровне клетки, клеточных органелл.

Фракционирование (отделение) клеток состоит из двух последовательных стадий: гомогенизации и разделения. На стадии гомогенизации структура ткани разрушается, и ткань превращается в так называемый гомогенат. На второй стадии разделении происходит группирование отдельных компонентов гомогената по принципу общности их физических свойств, таких, как размер и плотность.

При фракционировании нормальная активность клетки может в значительной степени нарушаться. Применяют особые приемы, чтобы свести последствия фракционирования до минимума и приблизить условия к естественным. Однако, все побочные явления, возникающие в ходе

14

растворителями, такими, как этилацетат и толуол.

Полученный гомогенный биологический материал изучают, пользуясь точными качественными и количественными аналитическими методами (исследования на молекулярном и атомном уровнях). При этом применяют целый ряд спектральных методов, радиоизотопные методы, электрохимических методов.

Все клетки в организме находятся в состоянии динамической активности и подвергаются действию внутренних и внешних факторов, которые в свою очередь также постоянно изменяются. В процессе жизнедеятельности любая отдельно взятая клетка взаимодействует с другими клетками, находящимися как в непосредственной близости от нее (межклеточные взаимодействия), так и на некотором расстоянии (гормональные эффекты).

Функционирование органеллы внутри клетки также в значительной степени зависит от активности других органелл и окружающей цитоплазмы. Именно поэтому нельзя достаточно полно изучить живую клетку, если делать это в отрыве от целого организма. В свою очередь изучение любой последовательности взаимосвязанных процессов, протекающих в какой-либо биологической системе, начинают, как правило, с изучения ее компонентов.

Наряду с этим, можно проводить эксперименты на препаратах, взятых из органов, тканей, клеток, на дрожжах, бактериях, вирусах. На ранних стадиях развития биохимии в качестве биологического материала использовали целых животных. Варьируя питание, удалось выяснить роль витаминов и отдельных аминокислот. В ходе этих исследований было сформулировано очень важное понятие – «незаменимое питательное вещество».

Химическое соединение называют незаменимым в том случае, если оно, с одной стороны, необходимо для сохранения равновесия процессов обмена во взрослом организме или для роста и развития детеныша, а с другой

– не может быть синтезировано самим организмом. Такое соединение обязательно должно поступать с пищей. Незаменимыми питательными веществами являются витамины и некоторые аминокислоты.

Изолированные органы. Например, печень можно искусственно сохранять и поддерживать жизнедеятельность, можно прокачивать жидкость (перфузионную) через собственную сеть сосудов, добавляя химические вещества, чью судьбу или воздействие на орган хотят изучить.

Гомогенаты органов. Растирание тканей в гомогенизаторе приводит к разрушению клеток, но сохраняются субклеточные структуры. Существует множество способов разделить органеллы клеток и изучать воздействие отдельных органелл на исследуемое вещество.

Дрожжи. Изучение дрожжей лежало в основе изучения спиртового брожения. В дрожжах много ферментов, и в течение многих десятилетий многие важные работы проводились на этих одноклеточных организмах. В частности, была выяснена судьба глюкозы в дрожжах, живущих в

15

анаэробных условиях. Эти превращения сходны с процессами в мышцах животных, и хотя сходство не абсолютно, но определило выбор более простых организмов для изучения процессов в высших организмах.

Бактерии. Бактерии отличаются большой биохимической активностью и очень большой скоростью размножения. Бактерии и вирусы могут служить моделями более сложных живых существ. Исследование этих моделей играет первостепенную роль в развитии биохимии.

Очищенные ферменты. Большое число ферментов удалось получить в чистом и даже кристаллическом виде, а затем исследовать их биохимическую активность как качественно, так и количественно.

Однако для трактовки результатов нужно иметь в виду – очищенные, вырванные из своего естественного окружения ферменты могут себя вести иначе, чем в клетке, т.к. в клеточной среде могут присутствовать компоненты, изменяющие структуру ферментов, число ферментов клетке очень велико, и они иногда образуют сложные полиферментные комплексы.

Таким образом, в клетке некое химическое соединение преобразуется под действием одного фермента, но продукт этого преобразования немедленно передается другому ферменту, который в свою очередь катализирует его преобразование. В результате складываются условия протекания реакции, весьма далекие от тех, которые наблюдает экспериментатор, работая с пробиркой.

1.6.2 С точки зрения биологического материала

Классическая биохимическая техника. Например, берут измельченные кусочки печени, добавляют вещество А, инкубируют при 37 градусах в течение часа, а затем измеряют концентрацию вещества А в сторону уменьшения. Если вещество А преобразуется в С, измеряют концентрацию С в сторону увеличения.

Недостатки метода: к биологическому препарату необходимо добавлять очень большое количество вещества А, хотя в живой клетке оно обычно находится в мизерных концентрациях, т.е. идет отклонение от физиологических условий – можно найти только то, что ищешь.

Изотопные методы. Радиоактивные изотопы можно использовать как при работе с целыми организмами, так и с использованием тканей и отдельных клеток. Схема такова: животному вводят радиоактивную аминокислоту, далее выделяют белок, тщательно очищают его от примесей, измеряют его радиоактивность. Можно проследить путь радиоактивного белка в организме и клетке. Можно проследить судьбу не только какого-то соединения, но и его частей.

Например, можно синтезировать глюкозу, в которой один атом углерода будет радиоактивным, что позволит следить за судьбой именно этого атома даже в том случае, если исходная молекула будет дробиться на более мелкие молекулы.

Хроматографические методы. Позволяют разделить сложные смеси веществ с целью выяснения состава смеси или выделить из нее отдельные

16

компоненты. Обобщенно процесс состоит в следующем: в стеклянную колонку с запором внизу плотно помещают какой-либо специальный твердый носитель (порошок, гель, ионообменную смолу).

Заливают смесь веществ, которые хотят разделить, затем через колонку пропускают жидкость, называемую элюэнтом, которая снимает (элюирует) компоненты смеси, но не все сразу, а последовательно.

В результате эти компоненты движутся вниз один за другим и могут быть получены раздельно, если их собирать небольшими фракциями, что позволяет анализировать достаточно однородные молекулы соответствующими методами дальше.

Спектрофотометрия. Здесь используется способность различных растворов поглощать свет определенной длины волн. Например, оксигемоглобин сильно поглощает свет в области длин волн 540 или 578 нм, белки вблизи 280 нм, нуклеиновые кислоты в области 260 и 600 нм. Существуют автоматические спектрофотометры, позволяющие плавно изменять длину волны света, падающего на исследуемый препарат с одновременной записью величины поглощения.

Рентгеноскопический анализ. Уникальный метод, позволяющий получить данные о пространственном расположении атомов в молекуле или кристалле. Пространственное расположение регулярно повторяющихся атомных или молекулярных ячеек определяют путем измерения углов и интенсивности отражения и рассеяния рентгеновских лучей определенной длины волны электронами, окружающими каждый атом. При облучении крупных биомолекул получают сложные дифракционные картины, которые расшифровывают с применением сложного математического анализа.

17

РАЗДЕЛ 2 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ПЛАН

2.1Этап «Протобиохимия»

2.2Экспериментальное изучение процессов жизнедеятельности в 17-18

вв.

2.3Этап «Новая химия»

2.4Формирование биологической химии в рамках редукционистских программ биологии второй половины 19 века

2.5Биологическая революция во второй половине 20 века

2.6История развития отечественной биохимии

2.7Развитие биохимии в Беларуси

Можно выделить основные этапы развития биохимической науки:

1.«Протобиохимия». Концепции процессов жизнедеятельности и их природы, развиваемые в древности, античности, в период средневековья. Концепции жизнедеятельности в Эпоху Возрождения, привлечение их для описания и объяснения химических процессов.

2.Экспериментальное изучение процессов жизнедеятельности в 1718 вв. Первые химические теории и объяснения процессов дыхания, пищеварения, брожения.

3.«Новая химия» и изучение методами химии живых организмов и процесс жизнедеятельности. Первый кризис методологии в области взаимодействия химии и биологии.

4.Формирование биологической химии в рамках редукционистских программ биологии второй половины 19 века. Развитие классической биологической химии.

5.Прогресс биохимии и революция в биологии во второй половине 20 века – формирование физико-химической биологии. Методологические, эмпирические и теоретические основы этого процесса. Интегрирующая роль физико-химической биологии в системе биологических наук.

2.1 Этап «Протобиохимия»

Изучение живой материи с химической стороны началось с того момента, когда возникла необходимость исследования составных частей живых организмов и совершающихся в них химических процессов в связи с запросами практической медицины и сельского хозяйства. Исследования средневековых алхимиков привели к накоплению большого фактического материала по природным органическим соединениям.

В 16-17 вв. воззрения алхимиков получили развитие в трудах ятрохимиков, считавших, что жизнедеятельность организма человека можно правильно понять лишь с позиций химии. Так, один из виднейших представителей ятрохимии – немецкий врач и естествоиспытатель Ф.

18

Парацельс выдвинул прогрессивное положение о необходимости тесной связи химии с медициной, подчёркивая при этом, что задача алхимии не в изготовлении золота и серебра, а в создании того, что является силой и добродетелью медицины.

Ятрохимики ввели в медицинскую практику препараты ртути, сурьмы, железа и других элементов.

Позже И. Ван-Гельмонт высказал предположение о наличии в «соках» живого тела особых начал, так называемых «ферментов», участвующих в разнообразных химических превращениях.

2.2 Экспериментальное изучение процессов жизнедеятельности в

17-18 вв.

В 17-18 вв. работали такие выдающиеся учёные как М.В. Ломоносов и А. Лавуазье, открывшие и утвердившие в науке закон сохранения материи (массы). Лавуазье внёс важнейший вклад в развитие не только химии, но и в изучение биологических процессов. Развивая более ранние наблюдения Майова, он показал, что при дыхании, как и при горении органических веществ, поглощается кислород и выделяется углекислый газ.

Одновременно им же, вместе с Лапласом, было показано, что процесс биологического окисления является и источником животной теплоты. Это открытие стимулировало исследования по энергетике метаболизма, в результате чего уже в начале 19 века было определено количество тепла, выделяемого при сгорании углеводов, жиров и белков.

Крупными событиями второй половины 18 века стали исследования Р. Реомюра и Л. Спалланцани по физиологии пищеварения. Эти исследователи впервые изучили действие желудочного сока животных и птиц на различные виды пищи (главным образом мясо) и положили начало изучению ферментов пищеварительных соков.

Возникновение энзимологии (учение о ферментах), однако, обычно связывают с именами К.С. Кирхгофа, а также Пейена и Персо, впервые изучивших действие на крахмал фермента амилазы in vitro. Важную роль сыграли работы Пристли и особенно Ингенхауса, открывших явление фотосинтеза (конец 18 века).

На рубеже 18 и 19 вв. были проведены и другие фундаментальные исследования в области сравнительной биохимии; тогда же было установлено существование круговорота веществ в природе.

Успехи статической биохимии с самого начала были неразрывно связаны с развитием органической химии.

2.3 Этап «Новая химия»

Толчком к развитию химии природных соединений явились исследования шведского химика К. Шееле (1742-1786 гг.). Он выделил и описал свойства целого ряда природных соединений – молочную, винную, лимонную, щавелевую, яблочную кислоты, глицерин и амиловый спирт и др.

19

Большое значение имели исследования И. Берцелиуса и Ю. Либиха, закончившиеся разработкой в начале 19 века методов количественного элементарного анализа органических соединений.

Вслед за этим начались попытки синтезировать природные органические вещества. Достигнутые успехи – синтез в 1828 году мочевины, уксусной кислоты (1844 г.), жиров (1850 г.), углеводов (1861 г.) – имели особенно большое значение, так как показали возможность синтеза in vitro ряда органических веществ, входящих в состав животных тканей или же являющихся конечными продуктами обмена.

Во второй половине 18 – начале 19 века были проведены и другие важные исследования: из мочевых камней была выделена мочевая кислота, из желчи – холестерин, из меда – глюкоза и фруктоза, из листьев зеленых растений – пигмент хлорофилл, в составе мышц был открыт креатин. Было показано существование особой группы органических соединений – растительных алкалоидов, нашедших позднее применение в медицинской практике. Из желатины и бычьего мяса путем их гидролиза были получены первые аминокислоты: глицин и лейцин.

2.4 Формирование биологической химии в рамках редукционистских программ биологии второй половины 19 века

Во Франции в лаборатории К. Бернара в составе ткани печени был открыт гликоген (1857), изучены пути его образования и механизмы, регулирующие его расщепление. В Германии в лабораториях Э. Фишера, Э. Ф. Гоппе-Зейлера, А. Косселя и других были изучены структура и свойства белков, а также продуктов их гидролиза, в том числе и ферментативного.

Всвязи с описанием дрожжевых клеток (1836-1838гг.) начали активно изучать процесс брожения (Либих, Пастер и др.). Вопреки мнению Либиха, рассматривавшего процесс брожения как чисто химический, протекающий с обязательным участием кислорода, Л. Пастер установил возможность существования анаэробиоза, то есть жизни в отсутствии воздуха, за счет энергии брожения. Бухнеру удалось получить из дрожжевых клеток бесклеточный сок, способный, подобно живым дрожжам, сбраживать сахар с образованием спирта и углекислоты.

Накопление большого количества сведений относительно химического состава растительных и животных организмов и химических процессов, протекающих в них, привело к необходимости систематизации и обобщений

вобласти биохимии. Первой работы в этом плане был учебник Зимона (1842). Очевидно, именно с этого времени термин «биологическая (физиологическая) химия» утвердился в науке.

ВРоссии первый учебник физиологической химии был издан профессором Харьковского университета А. И. Ходневым в 1847 году. Периодическая литература по биологической химии регулярно начала выходить с 1873 года в Германии. Позднее биохимические журналы начали издаваться во многих странах мира на английском, французском, русском и

20

других языках. Во второй половине 19 века на медицинских факультетах многих русских и зарубежных университетов были учреждены специальные кафедры медицинской, или физиологической химии.

Подлинный расцвет биохимии наступил в 20 веке. В самом начале его была сформулирована и экспериментально обоснована полипептидная теория строения белков (Э. Фишер 1901-1902гг.). Позднее был разработан ряд аналитическихметодов, позволяющих изучить аминокислотный состав белка (хроматография, рентгеноструктурный анализ, метод изотопной индикации, цитоспектрофотометрия, электронная микроскопия).

Расшифровывается первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура многих белков. Синтезируется ряд важных белковых веществ.

Выдающееся значение имели работы Л. Полинга, В. Виньо, Ф. Сэнгера, С. Мура, Д. Филлипса, Дж. Нортропа, М. М. Шемякина, Ф. Штрауба и др.

2.5 Биологическая революция во второй половине 20 века

Блестящие работы Чаргаффа, Дж. Уотсона и Ф. Крика завершаются выяснением структуры ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Устанавливается двухспиральная структура ДНК и роль ее в передаче наследственной информации. Осуществляется синтез ДНК и РНК. Решается (1962 и последующие годы) одна из центральных проблем современной биохимии – расшифровывается РНК – аминокислотный код. Вводится понятие о молекулярных болезнях, связанных с определенными дефектами в структуре ДНК хромосомного аппарата клетки.

Ранее классическими исследованиями И. П. Павлова и его школы раскрываются основные физиологические и биохимические механизмы работы пищеварительных желез. Устанавливается существование заменимых и незаменимых аминокислот, разрабатываются нормы белка в питании. Детальному изучению подвергаются особенности процесса азотистого обмена у растений. Особое место заняло изучение нарушений азотистого обмена у животных и человека при белковой недостаточности. Детально исследуются продукты распада гемоглобина, расшифровываются пути образования гема.

Выдающиеся успехи достигнуты в расшифровке структуры важнейших углеводов и механизмов углеводного обмена. Подробно выяснено превращение углеводов в пищеварительном тракте под влиянием пищеварительных ферментов и кишечных микроорганизмов. Выясняются биохимические механизмы нарушения углеводного обмена (диабет, галактоземия, гликогенозы и др.), связанные с наследственными дефектами соответствующих ферментативных систем.

Достигнуты успехи в расшифровке структуры липидов: фосфолипидов, цереброзидов, ганглеозидов. Создается теория b-окисления жирных кислот. Разработаны современные представления о путях окисления и синтеза жирных кислот и сложных липидов. Значительный прогресс достигнут при изучении механизма биологического окисления, тканевого дыхания.