Структурные формулы нуклеотидов,

используемых для обычного синтеза (А) и остановки синтеза ДНК (В)

•Фрагмент ДНК, последовательность которого требуется определить, добавляется в реакцию аналогичную ПЦР: реакционная смесь включает термостабильную ДНК-полимеразу, dNTP всех четырех типов и праймеры, выступающие в качестве затравок для синтеза дочерних цепей ДНК.

Принцип метода Сэнгера

•Удлинение цепи ДНК ферментом происходит до момента включения ddNTP. Разделение полученных фрагментов методом электрофореза в геле позволяет определить последовательность нуклеотидов.

Капиллярный автоматический секвенатор ABI

3130xl Applied Biosystems (США)

Метод гибридизации на твердой фазе

•В конце 1980-х был предложен подход к определению последовательностей ДНК, получивший название "секвенирование путем гибридизации" (sequencing by hybridization, SBH) или секвенирования на чипе.

•Метод основан на гибридизации меченных флуоресцентными метками одноцепочечных фрагментов ДНК с синтетическими олигонуклеотидами известной структуры и длины, которые точечно расположены на твердой основе.

•На подложке присутствуют все возможные варианты последовательности олигонуклеотида заданной длины. Например, для олигонуклеотида длиной в 8 оснований будут возможны 48=65 536 вариантов последовательностей.

•Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы только полностью комплементарные фрагменты ДНК взаимодействовали с олигонуклеотидом на подложке.

•После удаления несвязавшихся молекул ДНК можно зарегистрировать сигнал флуоресценции в тех участках чипа, где находится олигонуклеотид, комплементарная последовательность которого есть в секвенируемом образце ДНК.

•Полученный гибридизационный паттерн можно использовать для восстановления исходной последовательности путем сборки перекрывающихся участков сработавших проб.

Принцип метода секвенирования на чипе

•Однако, невозможно подобрать условия, при которых с олигонуклеотидами будут гибридизоваться только полностью комплементарные фрагменты. Всегда находятся GC-богатые участки, которые будут гибридизоваться и при наличии одного или даже нескольких неспаренных оснований. В связи с этим, метод SBH пока не нашел широкого практического применения. Тем не менее, алгоритмы, разработанные на основе SBH для сборки коротких прочтений в более длинные фрагменты, стали основой для последующих алгоритмов высокоскоростной сборки и выравнивания, используемых в технологиях секвенирования нового поколения (new generation sequencing, NGS).

Секвенирование с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization- time-of-flight) (определение нуклеотида по массе и заряду)

•Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать компоненты гетерогенной смеси биомолекул по разнице их молекулярных масс.

•Образец для анализа помещают на поглощающую УФ- излучение подложку и подвергают воздействию короткого лазерного импульса.

•Ионизированные молекулы летят в электрическом поле в направлении детектора.

•Время, за которое частица достигает детектора обратно пропорционально отношению масса/заряд.

•На основании полученных данных может быть вычислена масса анализируемой молекулы и расшифрована последовательность сравнительно короткого гомогенного фрагмента .