Принцип действия эмульсионной ПЦР
•Для оценки качества библиотеки, полученной с помощью эмульсионной капельной ПЦР исходят из правила, что соотношение числа "сработавших" микросфер к "несработавшим" должно быть примерно 30/70. Оценить количество сработавших микросфер можно посредством измерения флуоресценции несущих ДНК микросфер относительно несработавших.
Цифровая капельная ПЦР (цПЦР, ddPCR)
•Принцип цифровой ПЦР заключается в том, что реакционная смесь после добавления образца делится на десятки тысяч микрообъемов, в каждом из которых проходит независимая ПЦР.
•Это позволяет проводить амплификацию молекул ДНК и идентифицировать ПЦР-продукты, полученные с каждой отдельной ДНК-матрицы, при этом не требуются использовать стандарты.
•Данный метод незаменим для решения таких задач, как:
•Определение редких последовательностей ДНК, например, соматических мутаций клеток опухолей в парафинизированных гистологических срезах и биоптатах, даже при низком количестве целевой ДНК;
•Выявление наличия циркулирующих опухолевых клеток в очень небольшом титре у пациентов;
•Высокоточное определение количества копий гена, анализ экспрессии генов и miRNA единичных клеток в неоднородных популяциях;
•Оценка качества приготовления образцов для высокопроизводительного секвенирования (секвенирования нового поколения, new generation sequencing, NGS) для улучшения качества результатов сиквенса;
•Выявление загрязнения даже единичными бактериальными клетками или вирусными частицами;
Преимуществами цифровой ПЦР по сравнению с ПЦР в реальном времени являются:
•Прямое обнаружение редкого варианта мишени в сложном окружении;
•Исключительная чувствительность и точность даже при анализе единичных молекул ДНК;
•Отсутствие калибровочных кривых и отсутствие эффекта первых циклов ПЦР;
•Низкая чувствительность к присутствию ингибиторов.
Методы секвенирования нуклеиновых кислот
Метод химической деградации (Максама- Гилберта)
•Основан на нуклеотид-специфической химической деградации при обработке ДНК различными химическими агентами;
•предложен в середине 70-х годов ХХ века исследователями Гарвардского университета (США) Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом
•На первом этапе образец ДНК, обычно представляющий собой сравнительно короткий (100 - 1000 п.н.) гомогенный фрагмент, полученный, например, вырезанием полосы из геля после электрофоретического разделения образца ДНК, подвергнутого фрагментации с помощью эндонуклеаз, с одного из концов метят радиоактивной меткой.
•Затем образец разделяют на 4 части, после чего каждую из частей обрабатывают своим реагентом, приводящим к гидролизу ДНК по определенным основаниям (или по сочетаниям оснований).
•Параметры каждой реакции подбирают таким образом, чтобы гидролиз проходил не полностью, а лишь по некоторым позициям в каждой молекуле ДНК (в среднем, желательно получить одну модификацию на отдельную молекулу).
•В результате получают набор расщепленных фрагментов ДНК, соответствующих по длине местам нахождения нуклеотидов данного типа
Принцип метода Максама-Гилберта
•Псевдоу́зел— элемент вторичной структуры нуклеиновых кислот (в основном РНК), состоящий из двух шпилек, в которых половина стебля одной шпильки располагается между двумя половинами стебля другой шпильки.
Метод Сэнгера (остановка синтеза ДНК ферментом на дидезоксинуклеотидах (ddNTP))
•Предложен в 1975 г Фредериком Сэнгером и Аланом Кулзонизом;
•Основан на использовании ДНК- полимеразы и дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP), встраивание которых в синтезируемую цепочку ДНК приводит к остановке дальнейшего синтеза