Линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
•В данном подходе, олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР, метят флуорофором и гасителем флуоресценции. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизуется на ампликон, что ведет к ее разрушению за счет 5ʹ-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы
Пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП) (молекулярные "маячки", molecular beacons)
•В данной методике флуорофор и гаситель располагают на противоположных концах олигонуклеотида. Зонды, находящиеся в растворе при температуре ниже 55-60°С образуют структуру типа "стебель-петля" с очень низким уровнем флуоресценции. При гибридизации с ампликоном зонд разворачивается, что ведет к увеличению уровня флуоресценции
Метки, работающие на основе метода флуоресцентного резонансного переноса энергии (fluorescent resonance energy transfer, FRET)
Определение эффективности амплификации
•Эффективность реакции можно рассчитать как E=10-1/k,
где k берется из уравнения прямой Ct = k·log P0 + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При E=2 (максимально теоретически возможном значении) k ~ -3.32;
•Значения k < -3.32 соответствуют более низкой эффективности реакции. Желательно добиваться таких условий реакции, в которых эффективность амплификации составляет, по меньшей мере, 1.7 - 1.8 (k не больше -4 — - 4.2);
•Иногда k оказывается больше, чем -3.32, что соответствует теоретически невозможной ситуации E > 2. Небольшое превышение (-3.32 < k < -2.8) наблюдается относительно часто и может быть отнесено на счет погрешности измерений
Обработка данных ПЦР в реальном времени
•Методы обработки данных ПЦР в реальном времени основаны на применении уравнения (3). Существует два основных метода обработки данных ПЦР в реальном времени:
•- Метод калибровочного графика.
•- Прямое сравнение данных.
Метод калибровочного графика
•Этот метод предполагает построение
калибровочного графика в координатах Ct - log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах.
•График подчиняется уравнению: Ct = k·log P0 + b
Прямое сравнение данных
•Из уравнения (3) следует, что при равной эффективности реакции E в образцах 1 и 2, относительная концентрация субстрата (R) будет равна:
Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации с контрольной последовательностью REF (соответствующей, например, гену домашнего хозяйства). Пусть реакция REF в обоих образцах протекает с эффективностью Eref. Тогда:
Если эффективности "контрольной" и "опытной" реакций сходны, то можно записать:
Если обе реакции протекают со сходной эффективностью, близкой к 2, уравнение упрощается до вида:
Мостиковая ПЦР
•В случаях, когда поставленные задачи требуют проведения высокоэффективного секвенирования, 1536-ти луночного планшета (или даже сотни таких планшетов) для ПЦР оказывается недостаточно. В таких случаях требуются миллионы отдельных реакций, в каждой из которых будет получен гомогенный продукт ПЦР;
•Одним из методов, позволяющих решить данную задачу, является мостиковая ПЦР (bridge PCR).
•Принцип данного метода заключается в проведении ПЦР с праймерами, прикрепленными к твердой подложке, наподобие предметного стекла.
•С пришитого к поверхности праймера синтезируется фрагмент ДНК.
•После этапа денатурации, фрагмент снова взаимодействует с праймером на поверхности, образуя дугу (мостик) между двумя точками на подложке
•При повторных циклах ПЦР, из точки синтеза первого фрагмента колония фрагментов ДНК будет быстро расти.
•Технология мостиковой ПЦР используется для создания клональных библиотек фрагментов ДНК в приборах компании Illumina.
Эмульсионная ПЦР (emulsion PCR, ePCR)
•Эмульсионная ПЦР представляет собой распространенный вариант клонирования фрагментов ДНК in vitro. Эта методика позволяет амплифицировать ДНК на покрытых праймерами микросферах, так что каждая микросфера оказывается "облеплена" фрагментами только одного типа. Для этого создают библиотеку фрагментов ДНК с адаптерами по концам, а затем смешивают полученные фрагменты с покрытыми праймерами микрофсерами, свободным праймером, и остальными необходимыми для ПЦР компонентами в условиях мелкодисперсной водно-масляной эмульсии так, чтобы в каждую микрокаплю воды попали в среднем одна микросфера и один "стартовый" фрагмент ДНК. В ходе ПЦР, праймеры на микросфере инициируют синтез фрагментов, начиная с единственной матрицы, а с праймера, находящегося в растворе, достраивается вторая цепь. В итоге получают миллионы микросфер, каждая из которых несет миллионы идентичных фрагментов ДНК