Детекция амплификации ДНК в режиме реального времени
•Все существующие режимы регистрации накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени основаны на измерении флуоресценции реакционной смеси таким образом, чтобы интенсивность флуоресценции была пропорциональна количеству наработанной в ходе реакции ДНК.
•Способные к флуоресценции молекулы (флуорофоры) поглощают свет одной длины волны и испускают свет в более длинноволновой части спектра, что следует из основного постулата квантовой механики:
где E - энергия фотона, h - постоянная Планка (h = 6,626 070 15 × 10^−34 Дж·c), λ - длина электромагнитной волны, υ - частота электромагнитных колебаний, c - скорость света в вакууме (299 792 458 м / с).
Правило Стокса
Визуализация результатов ПЦР в реальном времени
•В настоящее время для визуализации результатов ПЦР в реальном времени используется весьма широкий спектр флуорофоров:
•SYBR Green;
•SYBR Gold;
•SYBR Blue;
•Alexa Fluor 488/532/633;
•ROX;
•Cy3, Cy5;
Существует несколько систем детекции амплификации ДНК в режиме реального времени, которые принято подразделять на специфические и неспецифические к определенной последовательности ДНК. Неспецифические системы детекции проявляют любую образовавшуюся в ходе реакции ДНК (включая и димеры праймеров), в то время как
специфические системы детекции позволяют достоверно регистрировать накопление фрагмента ДНК строго определённой последовательности. В свою очередь,
неспецифические системы детекции можно разделить на системы с использованием интеркалирующих красителей и системы с мечением праймеров флуоресцентными красителями.
Неспецифические системы детекции
•Интеркалирующие красители:
•Наиболее часто встречающийся в молекулярно- биологической лаборатории интеркалятор - бромистый этидий, применяемый для окрашивания ДНК при электрофорезе. Однако он плохо подходит для регистрации накопления ДНК в ходе реакции, поскольку негативно влияет на эффективность ПЦР;
•Наиболее распространенным вариантом красителя для ПЦР в реальном времени является SYBR Green I;
Кривая плавления продуктов ПЦР (сплошная линия). Прерывистой линией показан график первой производной. Значения максимумов первых производных принимаются за температуру плавления ампликонов
Фрагменты ДНК различной длины и состава будут плавиться (гибридизоваться) при разной температуре, что позволяет приблизительно оценить состав реакционной смеси после ПЦР. Данный подход имеет низкую разрешающую способность и обычно используется для различения димеров праймеров и длинных продуктов ПЦР
Меченные праймеры с адаптерной последовательностью (амплифлюры)
Существует несколько вариантов использования адаптерных 5ʹ-концевых последовательностей для регистрации накопления продукта ПЦР с участием флуоресцентно меченного праймера. В наиболее простом варианте, праймер несёт дополнительную последовательность на 5ʹ-конце, способную образовывать шпилечную структуру
•а - праймер содержит 5ʹ-адаптер с инвертированным повтором, по краям которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. При температуре элонгации, инвертированный повтор образует шпилечную структуру в которой флуорофор и гаситель оказываются сближены. В ходе синтеза второй цеп ДНК, шпилечная структура "разворачивается" и интенсивность флуоресценции возрастает. б - праймер содержит меченный 5ʹ-адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду с гасителем. Синтез второй цепи "сталкивает" олигонуклеотид с гасителем.
Специфические системы детекции
•Поскольку даже хорошо подобранная пара праймеров может давать нежелательные продукты амплификации (например, димеры праймеров) использование методик с регистрацией накопления только "нужных"
фрагментов ДНК является более надежным экспериментальным подходом. Все специфические системы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием в реакционной смеси меченного олигонуклеотида (одного или нескольких), неспособного выступать в качестве затравки и комплементарного уникальной части амплифицируемой последовательности. Меченный олигонуклеотид может быть прикреплен к праймеру или находиться в растворе в свободной форме.
Кспецифическим системам детекции относятся:
•Праймеры-пробы ("скорпионы");
•Линейные разрушаемые пробы (TaqMan);
•Пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП) (молекулярные "маячки", molecular beacons);
•Системы меток, работающих на основе метода FRET
Праймеры-пробы ("скорпионы")
•В основе данного методы лежит идея объединения праймера и гибридизационной пробы в одну молекулу. Для этого к 5ʹ-концу праймера прикрепляется адаптер со структурой типа "стебель-петля", в котором петлевая часть адаптерной шпильки комплементарна внутренней части образующегося фрагмента .
•Эта структура практически полностью повторяет праймеры типа "амплифлюр" с той лишь разницей, что адаптер отделен от праймера блокатором синтеза второй цепи ДНК во избежание его удвоения.
•Таким образом, после образования продукта реакции, петлевая часть адаптерной последовательности может гибридизоваться на внутреннюю часть фрагмента, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя флуоресценции и, как следствие, к усилению сигнала.