
Добавил:
l1irage
Сюда выкладываю свои солянки, сделанные в процессе учебы. Многое недоделано и недоработано, но я надеюсь, что мой труд вам поможет и вам хватит сил довести все до ума.
Передаю эстафету следующим поколениям)))
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:DNK-tekhnologii_v_meditsine-sokraschenny.pptx
X
- •ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК- ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ: МЕТОДЫ ПЦР И СЕКВЕНИРОВАНИЯ. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ
- •Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- ••Благодаря ПЦР стало возможным быстрое получение участков ДНК в чистом виде и достаточном
- •Классическая ПЦР
- •Праймеры для ПЦР
- •ОСНОВЫ СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ФОСФОРАМИДИТНЫМ МЕТОДОМ
- •ФОСФОРАМИДИТЫ НУКЛЕОЗИДОВ
- •Стадия 1 – отщепление DMTr
- •Стадия 2 - конденсация
- •Стадия 3 - окисление
- •Стадия 4 – детритилирование 2
- ••Поскольку праймеры должны быть комплементарны к участкам ДНК, ограничивающим амплифицируемый фрагмент, ПЦР можно
- •Состав реакционной смеси ПЦР
- •Схема 1-го цикла ПЦР
- •Амплификация целевых фрагментов ДНК в ходе ПЦР
- •ДНК-полимеразы
- ••Tth-полимераза (эубактерия Thermus thermophilus) - это также высокопроцессивный фермент, амплифицирующий до 3000 п.
- ••Pwo-полимераза (архебактерия Pyrococcus woesei) - молекулярная масса фермента около 90 кДа. Это процессивный
- •Визуализация результатов ПЦР
- •Применение ПЦР
- •Получение геномных (А) и кДНК (Б) копий с помощью ПЦР
- •Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний
- •ПЦР-анализ одного STR-локуса
- •Анализ трех STR-локусов методом ПЦР
- •Оборудование и материалы для ПЦР
- •Примеры обычного (А) амплификатора С1000 Touch, BioRad (США) и детектирующего амплификатора (Б)
- •Формат пробирок для проведения ПЦР
- •"Горячий старт" (Hot Start)
- •Добавление одного из компонентов реакции при высокой температуре
- •Разделение барьером
- •Ингибирование полимеразы антителами
- •Использование химически модифицированной полимеразы
- •Использование ингибиторов ДНК-полимеразы
- •ПЦР в реальном времени (Real-Time-PCR, qPCR, qRT- PCR)
- •Детекция кинетики ПЦР в реальном времени с помощью флуоресцентных зондов.
- •Амплификация ДНК происходит экспоненциально:
- •Прологарифмировав обе части уравнения (1) получим:
- •Детекция амплификации ДНК в режиме реального времени
- •Правило Стокса
- •Визуализация результатов ПЦР в реальном времени
- •Существует несколько систем детекции амплификации ДНК в режиме реального времени, которые принято подразделять
- •Неспецифические системы детекции
- •Кривая плавления продуктов ПЦР (сплошная линия). Прерывистой линией показан график первой производной. Значения
- •Меченные праймеры с адаптерной последовательностью (амплифлюры)
- •Специфические системы детекции
- •Кспецифическим системам детекции относятся:
- •Праймеры-пробы ("скорпионы")
- •Линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
- •Пробы с инвертированными концевыми повторами (ИКП) (молекулярные "маячки", molecular beacons)
- •Метки, работающие на основе метода флуоресцентного резонансного переноса энергии (fluorescent resonance energy transfer,
- •Определение эффективности амплификации
- •Обработка данных ПЦР в реальном времени
- •Метод калибровочного графика
- •Прямое сравнение данных
- •Мостиковая ПЦР
- ••При повторных циклах ПЦР, из точки синтеза первого фрагмента колония фрагментов ДНК будет
- •Эмульсионная ПЦР (emulsion PCR, ePCR)
- •Принцип действия эмульсионной ПЦР
- •Цифровая капельная ПЦР (цПЦР, ddPCR)
- ••Данный метод незаменим для решения таких задач, как:
- •Преимуществами цифровой ПЦР по сравнению с ПЦР в реальном времени являются:
- •Методы секвенирования нуклеиновых кислот
- •Метод химической деградации (Максама- Гилберта)
- ••На первом этапе образец ДНК, обычно представляющий собой сравнительно короткий (100 - 1000
- •Принцип метода Максама-Гилберта
- ••Псевдоу́зел— элемент вторичной структуры нуклеиновых кислот (в основном РНК), состоящий из двух шпилек,
- •Метод Сэнгера (остановка синтеза ДНК ферментом на дидезоксинуклеотидах (ddNTP))
- •Структурные формулы нуклеотидов,
- ••Фрагмент ДНК, последовательность которого требуется определить, добавляется в реакцию аналогичную ПЦР: реакционная смесь
- •Принцип метода Сэнгера
- ••Удлинение цепи ДНК ферментом происходит до момента включения ddNTP. Разделение полученных фрагментов методом
- •Капиллярный автоматический секвенатор ABI
- •Спектрограмма, полученная в результате секвенирования по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе
- •Метод гибридизации на твердой фазе
- •Принцип метода секвенирования на чипе
- ••Однако, невозможно подобрать условия, при которых с олигонуклеотидами будут гибридизоваться только полностью комплементарные
- •Секвенирование с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization- time-of-flight) (определение нуклеотида по массе
- •Принцип секвенирования ДНК на основе метода MALDI-TOF
- •Секвенирование лигированием (принцип комплементарности цепей ДНК)
- •Секвенирование методом лигирования
- •Пиросеквенирование (регистрация акта присоединения нуклеотида по образующемуся пирофосфату)
- •Принцип метода пиросеквенирования
- •Метод обратимых терминирующих нуклеотидов (регистрация каждого присоединенного нуклеотида по отщепляемой метке)
- ••Сначала любым методом создают иммобилизованную на твердой фазе клональную библиотеку одноцепочечных фрагментов ДНК
- •Метод обратимых терминирующих нуклеотидов
- •Полупроводниковое секвенирование (регистрация акта присоединения нуклеотида по образующимся ионам водорода)
- •Полупроводниковое секвенирование
- ••Как и в случае пиросеквенирования, у полупроводникового секвенирования есть трудности с детекцией гомополимерных
- •Нанопоровое секвенирование
- •Принцип нанопорового секвенирования
- ••В настоящее время, технологии Nanopore позволяют осуществлять:
- •Проект «Геном человека» Human Genome Project (HGP) 1990 - 2004
- ••Проект начался в 1990 году, под руководством Джеймса Уотсона под эгидой Национальной организации
- •Принцип секвенирования методом "дробовика"
- •Повторяющиеся участки затрудняют правильную сборку последовательности
- •Метод «клон за клоном» (clone-by-clone)
- •Расположение индивидуальных клонов фрагментов генома, содержащихся в BAC, на физической карте генома определяется
- ••Знание расположения сайтов рестрикции в каждом из клонов позволило определить их местоположение на
- •Генная терапия
- ••Генная терапия, в широком смысле, означает лечение путем введения в ткани или клетки
- •Генная терапия ex vivo
- •Генная терапия in vivo
- •Методы генетической трансфекции в генной терапии
- •Векторные системы на основе вирусов
- •Ретровирусные векторы
- •Конструкции ретровирусных векторов
- •Пакующая клеточная линия
- •Аденовирусные векторы
- •Векторы на основе аденоассоциированных вирусов (ААВ)
- •Векторы на основе вируса простого герпеса (HSV)
- •Образование HSV-вектора с помощью рекомбинации
- •Невирусные системы трансфекции
- •Антисмысловые нуклеиновые кислоты
- •Расщепление мРНК под действием рибозимов
- •Коррекция сплайсинга РНК с помощью антисмысловых олигонуклеотидов
- •мкРНК-интерференция
- •Рекомендуемая литература
- •Благодарю за внимание!

Визуализация результатов ПЦР
•ПЦР крайне чувствительна и может зарегистрировать присутствие единичной копии последовательности ДНК в образце, амплифицируя ее так, что эту ДНК становится возможным увидеть с помощью, например, окрашивания бромистым этидием (интеркалирующего агента, встраивающегося между цепями двойной спирали ДНК и вызывающего ее сверхспирализацию, в результате чего образовавшийся комплекс приобретает способность флуоресцировать в УФ-свете) после разделения гель-электрофорезом

Применение ПЦР

Получение геномных (А) и кДНК (Б) копий с помощью ПЦР

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний

ПЦР-анализ одного STR-локуса

Анализ трех STR-локусов методом ПЦР

Оборудование и материалы для ПЦР

Примеры обычного (А) амплификатора С1000 Touch, BioRad (США) и детектирующего амплификатора (Б)
CFX96 Touch, BioRad (США)

Формат пробирок для проведения ПЦР
•В настоящее время используют 4 стандартных формата отдельных или стрипованных пробирок для ПЦР:
•0,5 мл (0,6 мл);
•0,2 мл;
•0,025 мл (384-луночный формат);
•0,01 мл (1536-луночный формат);

Соседние файлы в предмете Биохимия