Стадия 4 – детритилирование 2
Далее вновь следует стадия детритилирования (стадия 4, рис. 2) и цикл повторяется. После присоединения последнего основания олигонуклеотид снимается с твердой фазы и с него удаляются оставшиеся защиты, что приводит к получению целевого олигонуклеотида.
•Поскольку праймеры должны быть комплементарны к участкам ДНК, ограничивающим амплифицируемый фрагмент, ПЦР можно использовать только для амплификации последовательности, начало и конец которой известны.
•В ходе каждого цикла репликации две цепи двухцепочечной ДНК разделяются и копируются независимо.
Состав реакционной смеси ПЦР
•Буфер со значением рН, оптимальным для используемой ДНК-полимеразы;
•dNTP 4-х типов (dATP, dGTP, dCTP и dTTP);
•Праймеры;
•ДНК-полимераза;
•Mg2+ (обычно, MgCl2);
•ДНК-матрица;
Схема 1-го цикла ПЦР
1)Плавление ДНК (90-96°С);
2)Отжиг праймеров (40-75°С);
3)Элонгация цепи;
где
k - число, находящееся в интервале 0<k<5. Обычно принимают k = 4.
Амплификация целевых фрагментов ДНК в ходе ПЦР
В результате каждого цикла количество копий амплифицированного фрагмента увеличивается как 2n , где n – количество циклов ПЦР
ДНК-полимеразы
•Taq-полимераза (эубактерия Thermus aquaticus) - фермент представляет собой одну полипептидную цепь с молекулярной массой 95 кДа. Данный фермент эффективно амплифицирует фрагменты длиной 3000-5000 п. н. и обладает хорошо выраженной 5ʹ-3ʹ-экзонуклеазной активностью, но не проявляет корректирующей 3ʹ-5ʹ- экзонуклеазной активности. Получаемые при использовании Taq-полимеразы фрагменты ДНК, как правило, содержат выступающий 3ʹ-концевой нуклеотид (чаще всего А), который нематрично присоединяется ферментом. Это свойство Taq-полимеразы используют для эффективного клонирования продуктов ПЦР в линеаризованные векторы с 3ʹ-выступающим Т.
•Tth-полимераза (эубактерия Thermus thermophilus) - это также высокопроцессивный фермент, амплифицирующий до 3000 п. н., имеющий молекулярную массу порядка 94 кДа, обладающий хорошо выраженной 5ʹ-3ʹ- экзонуклеазной активностью, но не проявляющий корректирующей 3ʹ-5ʹ- экзонуклеазной активности. Особенностью этой полимеразы является наличие ревертазной активности. Данный фермент обычно используют для проведения ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR).
•Pwo-полимераза (архебактерия Pyrococcus woesei) - молекулярная масса фермента около 90 кДа. Это процессивный фермент, обеспечивающий амплификацию до 3000 п. н., не проявляющий 5ʹ-3ʹ-экзонуклеазной активности, но обладающий выраженной 3ʹ-5ʹ- экзонуклеазной активностью.
•Pfu-полимераза (Pyrococcus furiosus) - молекулярная масса около 92 кДа. Pfu-полимераза характеризуется сравнительной процессивностью и эффективно амплифицирует фрагменты до 1000 п. н. Фермент обладает 3ʹ-5ʹ-экзонуклеазной активностью, наличие которой делает его пригодным для тех вариантов ПЦР, в которых необходимо получение продукта с высокой точностью синтеза (например, для последующего секвенирования).