Конструкции ретровирусных векторов

Генетическая карта типичного ретровируса: ψ+-последовательность, ответственная за упаковку; gag, pol и env – области, кодирующие соответственно белок капсида, белок, обладающий активностью обратной транскриптазы и интегразы, и белок оболочки. 5ʹ-LTR

– long terminal repeat (содержит сигналы инициации транскрипции, причем весь геном транскрибируется как одна молекула РНК). 3ʹ-LTR – содержит сигнал полиаденилирования.

Генетическая карта ретровирусного вектора, несущего 2 гена. Транскрипция терапевтического гена Х контролируется 5ʹ-LTR-промотором. Транскрипция селективного маркерного гена Neor - внутренним промотором р. ψ+-последовательность, ответственная за упаковку; Максимальный размер ДНК-вставки ~ 8000 п. н.

Пакующая клеточная линия

Аденовирусные векторы

•Для получения аденовирусного вектора проводят котрансфекцию клеточной линии, синтезирующей продукты аденовирусного гена Е1 двумя участками генома аденовируса.

•Один из них может существовать в виде плазмиды в E. Coli и содержит вместо Е1-области «терапевтический» ген, фланкированный нуклеотидными последовательностями аденовируса.

•Второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5ʹ-концевого участка, включающего Е1-область, и имеет перекрывающийся участок с несущей «терапевтический» ген плазмидой.

•Рекомбинация между двумя трансфецирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо Е1-области находится терапевтический ген.

•Продукты гена Е1, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса.

•Клонирующая ёмкость аденовирусного вектора составляет ~ 7,5 тыс. п.н.

Векторы на основе аденоассоциированных вирусов (ААВ)

•ААВ – это небольшие непатогенные вирусы человека с одноцепочечным ДНК-геномом (4,7 тыс. п.н.), который может интегрировать в специфический сайт 19-й хромосомы.

•Для продуктивной инфекции им необходимы белки другого вируса (помошника), например, аденовируса.

•После того, как ААВ попадает в ядро, его геном с помощью полимераз клетки-хозяина преобразуется в 2-х цепочечную ДНК и транскрибируется.

•Рекомбинантный ААВ получают с помощью котрансфекции клетки-хозяина, инфицированной вирусом-помошником (аденовирусом) двумя плазмидами:

•1) Одна из них несет «терапевтический» ген, фланкированный инвертированными концевыми повторами (ITR) ААВ;

•2) Вторая плазмида несет 2 гена ААВ – rep и cap, ответственные соответственно за репликацию генома и синтез капсида;

•После лизиса инфицированных клеток рекомбинантные ААВ отделяют от аденовируса с помощью центрифугирования и диализа, а оставшиеся в образце аденовирусы инактивируют нагреванием.

•Клонирующая ёмкость ААВ – 4,5 тыс. п.н.

Векторы на основе вируса простого герпеса (HSV)

•Геном HSV представлен 2-х цепочечной ДНК (152 тыс. п.н.).

•Капсид вируса сливается с мембраной нейрона и его ДНК транспортируется в ядро.

•Репродуктивный цикл вируса состоит из литической (репликация ДНК и сборка вирусных частиц) и латентной (конденсация вирусного генома и активация как минимум 2-х так называемых латентно-ассоциированных промоторов) фаз.

•Для получения HSV-векторов в плазмиду E. Coli, которая способна переносить до 8 тыс. п.н. чужеродной ДНК, встраивают усеченный геном HSV, состоящий из точки инициации репликации (ori-сайт) и последовательности, ответственной за упаковку, а также «терапевтический» ген (ампликон-плазмида).

•Ампликон-плазмиды трансфецируют в инфицированную вирусом-помошником клетку-хозяин.

•ДНК ампликона реплицируется по типу «катящегося кольца»: внутренняя кольцевая цепь играет роль матрицы, а во внешней происходит разрыв и к свободной 3ʹ-концевой ОН-группе ковалентно присоединяются нуклеотиды.

•10 ампликонов, соответствующие полноразмерному геному HSV упаковываются в капсид, который поставляет HSV-помошник, геном которого лишен последовательности, ответственной за упаковку.

Образование HSV-вектора с помощью рекомбинации

•Проводят котрансфекцию клетки-хозяина плазмидой, которая содержит «терапевтический» ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных областей HSV-генома, и ДНК HSV дикого типа.

•HSV-геном реплицируется в ядре по типу «катящегося кольца». При этом между фрагментами ДНК HSV, входящими в состав плазмиды и ДНК HSV дикого типа может произойти рекомбинация.

•Молекулы ДНК HSV дикого типа и рекомбинантного HSV упаковываются в вирусные частицы, высвобождающиеся из клетки после лизиса.

•Вирусы размножают и проводят скрининг бляшек для идентификации рекомбинантных HSV.