•Как и в случае пиросеквенирования, у полупроводникового секвенирования есть трудности с детекцией гомополимерных участков. В случае протяженного мононуклеотида, например
ТТТТТТТТ, сигнал теряет дискретность и определить, сколько именно нуклеотидов присутствует в последовательности становится затруднительно.
•Важным отличием полупроводникового секвенирования от других методов является отсутствие оптического детектора сигнала, что значительно упрощает и удешевляет конструкцию прибора. Кроме того, отсутствие необходимости оптической детекции снимает ограничение по количеству микроцентров секвенирования, которые можно разместить на чипе.
•На принципе полупроводникового секвенирования основана коммерческая технология IonTorrent, предоставляемая компанией Life Technologies Thermo Fisher Scientific. Разработки в данном направлении ведутся также компанией Roche.
Нанопоровое секвенирование
•Принцип метода заключается в регистрации изменений ионного тока, вызванного прохождением одноцепочечной ДНК через нанопору в тонкой пленке под действием электрического поля.
•Поры могут быть естественного биологического происхождения или искусственные.
•При переходе через пору, каждый тип азотистых оснований по-своему "закупоривает" пору и влияет на ток.
Принцип нанопорового секвенирования
•Проходящая через пору молекула одноцепочечной ДНК или РНК меняет потенциал на мембране.
•В настоящее время, технологии Nanopore позволяют осуществлять:
•1) Прямое прочтение нуклеотидных последовательностей цепей ДНК и РНК;
•2) Длина прочтения ограничена только длиной фрагмента;
•3) Наблюдение за ходом секвенирования в реальном времени дает возможность остановки процесса в любой момент при достаточном накоплении данных, при очевидных ошибках пробоподготовки или других сбоях в работе;
•4) Интерпретацию сигналов (base calling) и анализ данных можно проводить непосредственно в процессе секвенирования.
•5) Технология обеспечивает простой алгоритм сборки, полученных буквенных последовательностей.
Проект «Геном человека» Human Genome Project (HGP) 1990 - 2004
•Проект начался в 1990 году, под руководством Джеймса Уотсона под эгидой Национальной организации
здравоохранения США.
Принцип секвенирования методом "дробовика"
Повторяющиеся участки затрудняют правильную сборку последовательности
Метод «клон за клоном» (clone-by-clone)
•Вначале была создана геномная библиотека.
•Геном человека разбили на перекрывающиеся фрагменты длиной 100-200 тыс. п.н.
•Затем эти фрагменты лигировали в искусственные бактериальные хромосомы (bacterial artificial chromosomes, BAC), которые внедрили в клетки E. coli.
•BAC похожи на бактериальные плазмиды, но, в отличие от них, они могут включать гораздо большие фрагменты ДНК.
•Бактерии делились и копировали BAC, производя коллекцию перекрывающихся клонированных фрагментов.
•Затем было найдено местоположение каждого из этих фрагментов в геноме человека. Для этого была составлена рестрикционная карта каждого из клонов