ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК- ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНЕ: МЕТОДЫ ПЦР И СЕКВЕНИРОВАНИЯ. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

•метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) (polymerase chain reaction, PCR) предложен в 1983 г. сотрудником компании "Cetus" Кэри Муллисом (1944 - 2019);

•Нобелевская премия по химии (1993);

•Премия Японии (1993);

•Благодаря ПЦР стало возможным быстрое получение участков ДНК в чистом виде и достаточном количестве;

•На основе ПЦР были созданы современные технологии секвенирования нуклеиновых кислот (ДНК и РНК);

•Внедрение ПЦР в медицину открыло новое диагностическое направление - ДНК-диагностику;

•В настоящее время существует множество модификаций ПЦР:

•1) классическая ПЦР;

•2) ПЦР в реальном времени (real-time PCR, количественная ПЦР (quantitative, qPCR));

•3) мостиковая ПЦР (bridge PCR, bPCR);

•4) эмульсионная (emulsion PCR, ePCR);

•5) цифровая капельная ПЦР (digital drop PCR, ddPCR);

•Несмотря на большое разнообразие отдельных подходов, в основе всех разновидностей метода ПЦР лежит общий принцип способности нуклеиновых кислот к самокопированию (репликации).

Классическая ПЦР

•ПЦР может быть проведена целиком in vitro в бесклеточной среде.

•Заданную нуклеотидную последовательность можно выборочно и быстро реплицировать в больших количествах из любого образца ДНК.

•ПЦР основана на использовании ДНК-полимеразы для копирования образца ДНК в повторяющихся циклах репликации.

•ДНК-полимеразу направляют к необходимой последовательности ДНК-праймеры (затравки), представляющие собой короткие (18-24 нуклеотида) искусственно синтезированные ДНК-олигонуклеотиды.

•Праймеры добавляют в реакционную смесь, где они гибридизуются с образцом ДНК в начале и в конце необходимой последовательности и предоставляют 3ʹ-концы для ДНК-полимеразы, с которых она начинает репликацию обеих цепей.

•Последовательность самих праймеров необходимо подобрать таким образом, чтобы они были комплементарны участкам ДНК, фланкирующим (т.е. ограничивающим) необходимую последовательность.

Праймеры для ПЦР

ОСНОВЫ СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ФОСФОРАМИДИТНЫМ МЕТОДОМ

ФОСФОРАМИДИТЫ НУКЛЕОЗИДОВ

•В нашей лаборатории синтез олигонуклеотидов осуществляется на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-800 фирмы Biosset с использованием фосфорамидитного метода синтеза (Caruthers, M.H. (1983) Tetrahedron Lett. 24:245-248).

•Олигонуклетид синтезирузется в направлении от 3'- к 5'-концу. В ходе синтеза 3'-концевой олигонуклеотид ковалентно связан с твердофазным носителем - CPG (controlled pore glass). Мономерами при синтезе служат фосфорамидиты нуклеозидов:

Стадия 1 – отщепление DMTr

•Синтез начинается с деблокирования нуклеозида, находящегося на 5'-конце синтезируемого олигонуклеотида, при этом с 5'- OH группы удаляется диметокситритильная (DMTr) защитная группа (стадия 1).

Стадия 2 - конденсация

•Следующая стадия - конденсация, при которой активированный фосфорамидит нуклеозида кавалентно присоединяется к свободной 5'- гидроксильной группе концевого детритилированного нуклеозида (стадия 2).

Эффективность такого присоединения около 99%. Для того, чтобы не накапливалось ошибочных олигонуклеотидов за счет оставшегося 1% непрореагировавших 5'-концевых гидроксильных групп - их блокируют ("кэпируют") с помощью реакции ацетилирования. Минимальное количество молекул, которые оказались незаблокированными в процессе реакции "кэпирования" продолжают участвовать в ситнезе, и в результате после последнего цикла синтеза образуются более короткие продукты (олигонуклеотиды с пропущенными основаниями).

Стадия 3 - окисление

После реакции конденсации и "кэпирования" два концевых основания синтезируемого олигонуклеотида оказываются связанными нестабильной фосфитной триэфирной связью. Перевод ее в стабильную фосфотриэфирную связь осуществяется за счет реакции окисления (стадия 3), которая завершает цикл присоединения одного основания.