8. Классификация хромосом. Типы окрашивания хромосом.

Денверская классификация хромосом (1960) учитывает размеры и форму хромосом, положение центромеры и наличие вторичных перетяжек и спутников.

В основе Парижской классификации хромосом человека лежат методы окрашивания (бэндинга), позволяющие выявить комплекс поперечных полос (бэндов) на хромосоме.

В практике клинической цитогенетики выделены четыре основных типа дифференциального окрашивания хромосом по длине: G-, R-, С-, Q-методы.

1. G-окрашивание хромосом – самый распространенный метод в клинико-цитогенетической практике, базируется на предварительной обработке препаратов хромосом перед окраской и на использовании нефлюоресцентных красителей или их смесей типа Романовского–Гимзы. Предварительная (постфиксационная) обработка связана с инкубацией в солевых растворах и в растворах протеолитических ферментов (трипсина, различных протеаз). Идентификацию хромосом обеспечивает чередование темно и светло окрашенных полос. Темные полосы (G-полосы, G-бэнды) образуются в местах локализации гетерохроматина. Этот способ окрашивания позволяет идентифицировать хромосомы, выявлять делеции, инверсии, инсерции, транслокации, ломкие участки и более сложные перестройки.

2. Рисунок при R-окрашивании противоположен рисунку G-окрашивания: R-положительные полосы соответствуют G-отрицательным, и наоборот, R-отрицательные сегменты соответствуют G-положительным. Интенсивность окраски всех хромосом при этом методе обычно значительно слабее, чем при G-окрашивании.При модификации этого метода можно добиться так называемой Т-окраски, когда более активно выделяются теломерные районы при интенсивном окрашивании по Романовскому-Гимзе. В настоящее время метод R-окрашивания довольно редко используется в клинической практике отдельных лабораторий для уточнения хромосомных аномалий в спорных случаях после G-окрашивания.

3. При С-окрашивании в хромосомах определяются лишь центромерные и околоцентромерные районы хромосом и длинное плечо хромосомы Y. При данном способе окрашивается конститутивный хроматин. Смысл этого метода в том, что он выявляет структурный гетерохроматин во всех хромосомах и тем самым позволяет оценить хромосомный полиморфизм, а также уточнить характер хромосомных перестроек, особенно при идентификации перицентрических инверсий.

4. Q-окрашивание. При этом типе окрашивания хромосомы обрабатывают различными флюорохромами и анализируют их с помощью флюоресцентной микроскопии. Из флюорохромов чаще всего применяют производные акридина: акрихин (атебрин) и акрихин-иприт. Рисунок каждой хромосомы специфичен по числу, положению и размеру полос по-разному светящихся сегментов, что обеспечивает идентификацию всех хромосом.

9. Fish - окрашивание. Кариотипирование. Области применения.

FISH-анализ (Fluorescence In Situ Hybridization) — цитогенетический метод, применяющийся для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ, а также для выявления специфических мРНК в образце ткани (установление пространственно-временных особенностей экспрессии генов в клетках и тканях).

Метод FISH-анализа использует короткие флуоресцентно-меченые последовательности ДНК (зонды), комплементарные по отношению к исследуемым последовательностям. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. Гибридизация проводится в препарате на предметном стекле с использованием специальных термостатов-гибридайзеров. Дальнейшая обработка производится путем флуоресцентной микроскопии и специального программного обеспечения.

Области применения FISH-анализа: преимплантационная генетическая диагностика (ПГД);пренатальная диагностика;постнатальная диагностика (уточнение/верификация результатов стандартного цитогенетического исследования; исследование сложных перестроек — тройных и более сложных транслокаций, инсерций; определение степени мозаицизма; исследование природы маркерных хромосом; исследование хромосомных перестроек в онкогематологии; диагностика солидных опухолей; скрининг анеуплоидий сперматозоидов).

Кариотипирование — цитогенетический метод определения кариотипа (совокупность признаков полного набора хромосом биологического вида, организма, клеточной линии).Для определения кариотипа используются клетки в метафазе митоза (используют, как правило, лимфоциты периферической крови, также могут быть использованы клетки костного мозга или первичная культура фибробластов кожи). Для увеличения числа клеток их культивируют в специальной среде с использованием фитогемагглютинина (ФГА).На стадии метафазы к культуре клеток, незадолго перед фиксацией, добавляют колхицин, который блокирует образование микротрубочек, тем самым препятствуя расхождению хроматид к полюсам деления клетки и завершению митоза. Далее проводят гипотоническую обработку клеток.

Гипотоническая обработка вызывает набухание клетки, разрушение межхромосомных связей, что способствует отделению хромосом друг от друга. Затем проводят фиксацию препаратов, которая сохраняет структуру хромосом и удаляет остатки цитоплазмы. После фиксации препараты метафазных хромосом окрашивают и фотографируют, используя исследовательские микроскопы с цифровыми камерами.

Из микрофотографий формируют кариотип — нумерованный набор пар гомологичных хромосом. Далее производится анализ полученных изображений при помощи специальных программ.

Области применения кариотипирования: выявление различных хромосомных аномалий (числовых и структурных);цитогенетический анализ животных и растений для выявления селекционной ценности, чистопородности, генетической паспортизации.