Опера о чуме (учебник)

одежда больного, медицинский инструментарий (вспомним слова Даниила Самойловича Самойловича-Сущинского: «хотя [я] очищал от гноя свои биструи и ланцеты… я не только всегда имел дело с чумным ядом, но… яд этот всегда был в моих карманах»).

Аэрогенный механизм (синие стрелки) реализует передачу инфекции через контакт с больным лёгочной формой чумы (воздушнокапельный путь), а также через разделанные туши инфицирован-

ных животных (воздушно-пылевой путь).

Фекально-оральный механизм (коричневые стрелки) реализует передачу инфекции при контакте человека с фекалиями и мочой инфицированного животного, чаще всего домашнего (собаки или кошки). Реализуется крайне редко. Алиментарный путь этого механизма (зелёные стрелки) реализует передачу инфекции через употребление в пищу инфицированных продуктов, не прошедших термической обработки (Y. pestis погибает при 50°С за 30–40 минут, при кипячении – за минуту).

Кроме того, существуют дополнительные пути, которые реализуются комбинацией механизмов. Так, кошка, инфицированная через укус блохи или употребившая в пищу носителя-грызуна, помимо передачи трансмиссивным механизмом через блоху, в случае развития лёгочной формы заболевания может передать инфекцию аэрогенным механизмом (воздушно-капельным путём). При разделке тушки инфицированного животного (суслика, сурка, зайца, верблюда), помимо контактного механизма и алиментарного пути, возможна реализация аэрогенного механизма (воздушно-пылевым путём через вдыхание инфицированного аэрозоля человеком, занимающимся разделкой туши). Таким же образом возможно заражение при препарировании суслика (вспомним, как погиб Ипполит Александрович Деминский). Инфицирование птицы может осуществляться через укус блохи (например, Ceratophyllus borealis, Frontopsylla frontalis) или употребление в пищу носителя-грызуна. Далее возможен вынос инфекции за пределы очага, где она может

Рис. 5.6. Схема механизмов и путей распространения чумы ► Пунктирными линиями обозначены пути,

реализация которых случается редко

80

81

быть распространена через погадки (т. е. спрессованные непереваренные остатки пищи), тушку самой птицы и блоху. Возможно заражение в лаборатории при аварии во время работы с культурой или при заражении лабораторных животных. В данном случае возможна реализация как трансмиссивного механизма (повреждение кожных покровов), так и аэрогенного (воздушно-капельно). Наконец, носитель или блоха могут быть через транспорт (например, корабль, самолёт, автомобиль) доставлены в любой уголок планеты, как, например, крыса, с которой началась первая пандемия чумы. Конечно, когда носитель отправляется в путешествие один, необходимо, чтобы по прибытии его встречал воспримчивый организм, например, блоха или человек, который употребит его в пищу, хотя заражение человека непосредственно от грызуна через укус тоже возможно, но случается редко.

Важно понимать, что разделение путей передачи инфекции на основной, второстепенные и дополнительные связано исключительно со значением вероятности его реализации, однако даже самый маловероятный путь, например, употребление в пищу погадок инфицированной птицы, способен стать началом новой эпидемии, поскольку естественная восприимчивость человека к чуме чрезвычайно высока и не зависит от пола и возраста. Вероятно именно поэтому в хадисе1, рассказанном Áишей и Абдуррахмáном ибн Ауфом аль-Курáши (VII век) сообщается, что любая эпидемия (и особенно чума) посылаются Всевышним как наказание и милость для человека, поскольку страдание от неё приравнено к страданию мучеников. Поэтому, «если кто услышит, что началась где-то эпидемия [чумы], не ходи туда но если случилась она в твоей земле, то не покидай её, желая спастись, но оставайся, дабы не распространить».

1 С араб. «предание» в исламе сообщение о словах или действиях пророка Мухаммада, которое передано достоверными передатчиками, чья духовность и нравственность достоверны и не подвергаются сомнению. Каждый хадис имеет непрерывную цепочку передатчиков (инсад), что является подтверждением его достоверности. Сбором и изучением на достоверность занимаются учёные-мухаддисы, среди которых наиболее авторитетным является имам Мухаммад ибн Исмаил аль-Бухари (810–870), который для своего сборника «аль-Джами’ ас-Сахи» исследовал порядка 700 тысяч известных хадисов, отнеся к достоверным около 1%. Данный хадис (перевод с арабск. автора) приводится аль-Бухари под № 3474 и № 6619.

82

До настоящего времени мы много говорили о возбудителе чумы, но всё ещё не познакомились с ним. Настало время это исправить.

Yersinia pestis, относящаяся к роду Yersinia семейства Yersiniaceae

порядка Enterobacterales, является грамотрицательной небольшой (1–3 х 0,5–0,7 мкм) прямой или овоидной1 палочкой, которой присущ полиморфизм (могут встречаться длинные палочки и кокки). Но оставим микробиологическое знакомство для соответствующей главы, остановившись на внутреннем мире бактерии – её генетической структуре.

Как мы уже говорили ранее, геном чумного микроба состоит из хромосомы и трёх плазмид, из которых одна родоспецифичная (т. е. общая для всех патогенных бактерий рода Yersinia) и две видоспецифичные («собственные»). Все три плазмиды являются неконъюгативными (нетрансмиссивными), то есть неспособными в процессе конъюгации передаваться от одной бактериальной клетки к другой2. Первое обнаружение и доказательство их роли в вирулентности принадлежит группе учёных под руководством уже знакомого нам Игоря Валериановича Домарадского (диплом на открытие «Плазма» № 001 от 27 июня 1983 года приоритет от 27 октября 1977 года)3, чей приоритет долгое время был неизвестен мировой науке, поскольку проводимые исследования и открытия составляли государственную тайну. Размеры генома варьируются в зависимости от штамма: для хромосомы они составляют 4,5– 4,78 Мб4, для плазмиды pCad составляют 68,1–71,5 Кб, для плазми-

1Короткие толстые палочки, несколько вздутые посередине, с закруглёнными концами, по форме напоминающие бочонки.

2Передача возможна только путём мобилизации гетерологичными конъюгативными плазмидами или трансдукции.

3 Косвенные указания на наличие собственных плазмид были получены Е. Г. Кольцовой (1970).

4 Поскольку ДНК представляет собой двуцепочечную молекулу, снизанную из азотистых оснований нуклеотидов, длину всей молекулы принято выражать в количестве пар нуклеотидов (п. н.) или пар оснований (п. о.), что по-английски base pair, поэтому тысяча п. о. выражается в килобазах (Кб), миллион п. о. – в мегабазах (Мб), миллиард п. о. – в гигабазах (Гб).

83

ды pFra составляют 96,2–137 Кб и для плазмиды pPla составляют

9,6–10,7 Кб.

Геном чрезвычайно богат инсерционными (т. е. мобильными) последовательностями, полученными в результате горизонтального переноса генов (преимущественно от других бактерий), и демонстрирует аномалии смещения состава оснований гуанин – цитозин, когда их избыточно или мало в определённой области нуклеиновой кислоты1, что указывает на частую внутригеномную рекомбинацию. Кроме того, как уже говорилось ранее, геном содержит 150 псевдогенов, из которых многие являются остатками «былой юности» – энтеропатогенного (т. е. кишечного) образа жизни ещё как Y. pseudotuberculosis.

Хромосома

На хромосоме располагается область пигментации pgm, которая включает локус hms (вспомним: кодирует белки аккумуляции гемина, играющие ведущую роль в создании биоплёнки и блока у блох) и остров высокой патогенности (HPI, от англ. high pathogenicity island), размером 35–45 Кб, на котором локализованы гены региона ybt, участвующие в биосинтезе сидерофора (от греч. «носитель железа») йерсиниобактина (Ybt, от анг. Yersiniabactin), который является одним из видов металлофоров (т. е. носителей металлов). Молекула Ybt образует устойчивый комплекс с железом (YbtFe3+) за счёт пяти «активных центров» (бензольное кольцо, два тиазолидиновых кольца и два тиазолиновых кольца). Данный комплекс распознаётся соответствующим рецептором наружной мембраны бактерии и транслоцируется в цитозоль, где железо высвобождается и используется бактерией. То есть осуществляется «захват» связанного с белками железа хозяина (например, гемоглобина), что обеспечивает бактерии выживание в обеднённых железом средах и размножение в крови млекопитающих. Соответственно потеря HPI делает штамм авирулентным2. Другим открытым не-

1Так называемый GC-перекос (GC skew), когда, в случае бактерий и архей, нуклеотидные композиции ассиметричны: одна нить ДНК содержит больше гуанина и тимина, а другая – аденина и цитозина.

2Некоторые штаммы SNP-типа 0.РЕ4 (центральноазиатские) имеют HPI, но авирулентны для человека. Сравнительный анализ генов ybt показал, что в гене ybtS этих

84

давно металлофором является йерсинопин (один «активный центр» – имидазольное кольцо), который гомологичен опинам, синтезируемым некоторыми нитчатыми грибами, мхами и бактериями (например, S. aureus, P. aeruginosa) для «захвата» ионов цинка, железа и никеля.

Рядом с pgm-областью располагаются гены, отвечающие за секрецию поринов – белков внешней мембраны, которые действуют как поры, отвечая за перенос метаболитов через внешнюю мембрану и выделение ионов для поддержания осмотического давления. В частности, порины OmpF, OmpA и TolC обеспечивают выживание микроба в виде L-форм в среде хлорида натрия. Интересно, что многие высоковирулентные штаммы несут ген ompY (отвечающий за секрецию порина OmpY), инактивированный IS100-элементом, что может приводить к элиминированию (исчезновению) pgm- области (и, следовательно, HPI, что сделает штамм авирулентным). Данная способность, по-видимому, является своеобразным регулятором численности высоковирулентных штаммов, отличающихся молниеносностью инфекционного процесса. Избирательное элиминирование pgm-области обеспечивает стабильное протекание эпизоотий с доминирующим участием штаммов с избирательной вирулентностью, инфекционный процесс с участием которых протекает медленнее, но которые не имеют IS100-элемента (штаммы неосновных подвидов). И это логично, поскольку отсутствие такого «регулятора» быстро бы привело к смерти всех носителей и, следовательно, окончанию эпизоотий в очаге. Эту мысль также подтверждает тот факт, что внедрение IS100-элемента в ген порина у Y. pseudotuberculosis не приводит к элиминированию pgm-области.

Также на хромосоме располагается psa-оперон1, который кодирует синтез рН6-антигена (pH6-Ag; Psa; PsaA) при 37°С и рН ≤ 6 (кислая среда), представляющего собой фимбрии (пили), то есть нитевидные белковые структуры, расположенные на поверхности бактериальной клетки. Данный антиген обеспечивает связывание

штаммов, в позиции 661, имеется замена цитозина на тимин (пишут: «С→Т»), что приводит к синтезу аминокислоты серин (вместо пролина) в белке YbtS. Вполне вероятно, что указанное приводит к невозможности синтеза йерсиниобактина и, следовательно, является одной из причин авирулентности.

1 Функциональная единица генома у прокариот.

85

бактерии с клетками альвеолярного эпителия за счёт соединения с фосфатидилхолином, расположенным на поверхности мембраны эпителиальной клетки. Также он обеспечивает ингибирование (т. е. снижение, замедление) фагоцитоза макрофагов. Ранее считалось, что это обеспечивается путём адгезии (т.е. прикрепления) бактерий за счёт пилей (рН6-антигена) с последующей доставкой Yop-белков (о них далее), синтез которых кодируется плазмидой pCad. Однако опыты1 с использованием штаммов синтезирующих и не синтезирующих рН6-антиген показали, что нет различия в прикреплении к макрофагам, но существует существенная разница между распределением клеток внутри макрофага. Так, штамм, синтезирующий рН6-антиген (Psa-позитивный)2 показал примерно вдвое более низкое количество захваченных микробных клеток (Рис. 6.1). Таким образом, ингибирование фагоцитоза в данном случае обеспечивается не адгезией и доставкой Yop-белков, а предотвращением захвата макрофагом бактериальной клетки (т. е. бактерии прикрепляются к макрофагу, но благодаря рН6-антигену в массе своей не поглощаются им). Здесь следует напомнить, что рН6-антиген синтезируется при рН ≤ 6 (в фаглизосоме макрофага), значит он обеспечивает защиту только от повторного поглощения макрофагами, когда инфекционный процесс от внутриклеточной фазы перешёл к внеклеточной. Кроме того, рН6-антиген агглютинирует эритроциты, что высвобождает железо для его последующего захвата йерсиниобактином, а также связывается с липопротеинами плазмы крови, содержащими аполипопротеин В (ароВ), что препятствует распознаванию возбудителя иммунной системой организма (при этом антитела к apoB не препятствуют связыванию бактерии с липопротеинами).

Кроме того, на хромосоме располагается ген ail, который коди-

рует синтез белка Ail (от англ. attachment invasion locus [protein]),

располагающегося на внешней мембране. Данный белок выполняет несколько функций. Во-первых, он обеспечивает сывороточную

1 Huang X.-Z., Lindler L. E. The pH6 antigen is an antiphagocytic factor produced by Yersinia pestis independent of Yersinia outer proteins and capsule antigen. Infect Immun. 2004; 72(12):7212– 7219; DOI: 10.1128/IAI.72.12.7212-7219.2004.

2 Принято писать «Psa+» или «PsaA+», чтобы отличить их от штаммов, не синтезирующих рН6-антиген или Psa-негативных (пишут «Psa-» или «PsaA-»). Данная запись показывает отсутствие (или наличие) того или иного фактора у штамма.

86

резистентность, предотвращая бактериальный лизинг во всём диапазоне температур (от 6°С во время зимней спячки до 37°С в теле млекопитающего), что особенно важно при отсутствии синтеза адгезина YadA (вспомним: ген yadA у Y. pestis инактивирован). Вовторых, Ail обеспечивает связывание бактерии с клеткой млекопитающего, в том числе через взаимодействие с компонентами внеклеточного матрикса, что повышает скорость доставки Yop-белков, разрушающих клетку млекопитающего изнутри (цитотоксическое действие). Чаще всего доставка Yop-белков осуществляется в макрофаги, которые выступают в роли клеток-хозяев. В-третьих, Ail обеспечивает инвазию бактерии в непрофессиональные фагоциты (фибробласты, эпителиальные клетки и т. д.) и способствует аутоагрегации, то есть формированию скоплений (агрегатов), что играет важную роль как в формировании бубона (образование конгломератов в макрофагах лимфатических узлов), так и развитии лёгочной формы заболевания.

Рис. 6.1. Конфокальная флуоресцентная микроскопия макрофагов RAW264.7, инфицированных штаммами Y. pestis.

Бактериальные клетки внутри макрофагов помечены зелёным, вне макрофагов – оранжевым (Huang X.-Z., 2004; публикуется по лицензии The American Society of Microbiology, разрешение передано через Copyright Clearance Center, Inc):

А – штамм Y. pestis KIM5–3001 (PsaA+); В – штамм Y. pestis KIM5–3001.1 (PsaA-)

87

Отдельного внимания заслуживают участки хромосомы, которые являются профагами – геномами встроившихся умеренных бактериофагов. Первый умеренный бактериофаг чумного микроба, названный фагом Н, был выделен1 в 1965 году Николаем Николаевичем Новосéльцевым2 из органов морской свинки, погибшей от чумы. На следующий год им же был выделен второй умеренный бактериофаг Н-I уже из культуры штамма Y. pestis EV НИИЭГ (подробнее об этом штамме в Главе 26).

Помимо уже рассмотренного ранее бактериофага Ypfϕ, отдельного внимания заслуживает нитчатый бактериофаг CUS-2, чей геном также встроен в хромосому чумного микроба. Этот профаг инактивирует ген rovA, кодирующий регулятор транскрипции RovA, продукция которого осуществляется при температуре 37°С и активирует psa-оперон. При этом у других патогенных йерсиний RovA участвует только в инвазии, то есть интегрирование профага изменило его функции. В предыдущих главах мы говорили, что синтез внеклеточного матрикса для образования биоплёнки осуществляется продуктами генов hms, синтез которых стимулирован продукцией регулятора транскрипции RovM. Таким образом, можно заключить, что гены, ответственные за синтез регуляторов RovM и RovA включаются попеременно в зависимости от температуры, а все сложные процессы, приводящие к блокированию блохи и устойчивости к фагоцитозу (по сути, выживание как внутри хладнокровного переносчика, так и теплокровного носителя), стали возможными благодаря удачной интеграции генома бактериофага CUS-2 в геном чумного микроба.

Плазмида pCad (pYV, pVW, pLcr и pCD13)

Родоспецифичная плазмида, получившая название плазмида кальцийзависимости ввиду способности определять терморегулирующую зависимость клеток от ионов кальция. Также именуется плазмидой вирулентности. В первую очередь она интересна тем, что несёт так называемые гены LCR (от англ. low-Ca2+-response), кото-

1Новосельцев Н. Н. Умеренный фаг чумного микроба. Автореферат дис. … доктора медицинских наук, Саратов, 1973, 44 с.

2Советский врач, бактериолог.

3Все эти названия используются в современной научной литературе.

88

рые при 37°С в ответ на низкое содержание Ca2+ обеспечивают синтез белка вирулентности LcrV, открытого в 1956 году 1 как V- антиген2. В случае контакта с клеткой млекопитающего он играет роль в реализации системы секреции III типа 3 (проникновения внутрь клетки млекопитающего). Возможна реализация и альтернативного механизма (Рис. 6.2), когда LcrV проникает из бактериальной клетки в клетку млекопитающего с помощью транспортирующего контактно-активируемого транслокатора (VCAT, от англ.

LcrV-transporting contact-activated translocator). Попав в цитоплазму клетки млекопитающего одним из способов, LcrV, вероятно, играет иммунодепрессивную роль (подавление TNFα и IFNγ). С другой стороны, синтез LcrV стимулирует секрецию Yop-белков (от англ. Yersinia outer proteins), гены которых разбросаны по всей плазмиде. LcrV взаимодействует с LcrG, что позволяет белкам (в первую очередь YopB, YopD и YscF) организовать структуру, которую принято называть молекулярной иглой («свободный» LcrG блокирует её построение, поэтому LcrV как бы «отодвигает» LcrG подобно тому, как отодвигают ворота), а затем нацеливает иглу на контакт с клеткой млекопитающего (клеткой-мишенью), обеспечивая проникно-

вение эффекторных Yop-белков (YopE, YopH, YopJ/YopP, YopM, YpkA/YopO) в цитоплазму клетки млекопитающего (Рис. 6.2). Эти белки работают вместе, чтобы разрушить цитоскелет клетки млекопитающего и нарушить регуляцию сигнальных путей. Например, YopE имитируют белки, активирующие ГТФазу, что приводит к подавлению сигнальных белков Rho ГТФазы, играющих важную роль во множестве общих клеточных функций. YopT расщепляет и высвобождает связанные с мембраной Rho ГТФазы. YopJ представляет собой ацетилтрансферазу, блокирующую передачу сигналов

1Burrows T.W., Bacon G.A. The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining virulence. Br J Exp Pathol. 1956; 37(5):481–493.

2Открыт совместно с поверхностным липопротеином W-антигеном (функция

неизвестна) и некоторое время их объединяли в VW-антиген ввиду сложности раз-

деления (см. Burrows T.W., Bacon G.A. V and W Antigens in Strains of Pasteurella pseudotuberculosis. Br J Exp Pathol. 1960; 41(1): 38-44). Термин «V-антиген» всё ещё встре-

чается в научной литературе.

3 Один из видов бактериальной системы секреции, с помощью которой белки из бактериальной клетки проникают в клетку-хозяина (клетку млекопитающего). Некоторые бактерии используют эту систему для изменения структуры клеточной стенки хозяина, с целью последующего проникновения в клетку.

89