Опера о чуме (учебник)

фаты (dNTR, «строительные блоки») и по одному из дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ddNTR, грубо говоря, по одной «букве»), у которых отсутствует 3’-гидроксильная группа, ввиду чего ДНКполимераза, дойдя до них, обрывает цепь («стоп-блок»). Таким образом, поскольку дезоксирибонуклеотиды встраиваются хаотично, на выходе в каждой из четырёх пробирок, соответствующих определённой «букве» ДНК, будет наработано множество фрагментов ДНК различной длины, с одного конца меченных радиоактивным изотопом, а с другой – «стоп-блоком». Далее проводят электрофорез (на каждом ряду своя «буква»), рабочая зона 4–1 на котором с помощью радиоактивной метки можно увидеть лестницу, по которой «буква за буквой» считывают последовательность нуклеотидов в исследуемом фрагменте.

Метод прост и элегантен, поэтому применяется до настоящего дня, за тем исключением, что он полностью автоматизирован и проводится на специальных приборах – секвенаторах. Кроме того, используют дезоксирибонуклеотиды, меченные флуоресцентными метками с разными длинами волн, что позволяет проводить реакцию в одной пробирке.

Со временем были предложены новые методы секвенирования1, позволившие к 2001 и 2002 году расшифровать полные последовательности геномов штаммов Y. pestis CO922 и Y. pestis KIM3 соответственно, что привело к множеству открытий, среди которых обнаружение огромного количества псевдогенов, независимых кластеров генов, кодирующих различные фимбрии и адгезины, а также генов, кодирующих ранее неизвестные поверхностные адгезины, но что самое интересное – способность генома Y. pestis к частой внутригеномной рекомбинации! О важности этих работ наглядно говорит их громадная цитируемость в научной литературе.

1 Разработанный Фредериком Сенгером принцип лёг в основу технологий, значительно упростивших процесс секвенирования, среди которых в настоящее время лидирующие позиции занимают Oxford Nanopore, Illumina, IonTorrent, DNBSEQG50, MGI и PacBio. Однако всё ещё достаточно остро стоит вопрос ошибок (особенно при «прочитывании» больших фрагментов) и интерпретации полученных данных («сборки» геномных последовательностей).

2Parkhill J., Wren B. W., et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Nature. 2001; 413(6855):523–527; DOI: 10.1038/35097083.

3Deng W., Burland V., et al. Genome Sequence of Yersinia pestis KIM. J Bacteriol. 2002; 184(16):4601–4611; DOI: 10.1128/JB.184.16.4601-4611.2002.

490

Андрей Владимирович Кáрлышев1, один из участников программы по секвенированию генома чумного микроба

(Yersinia pestis Genome Sequencing Project), во время доклада о результатах полногеномного секвенирования штамма Y. pestis CO92,

8th International Symposium of Yersinia, 4–8 сентября 2002 года, Финляндия

(любезно предоставлено Андреем Павловичем Анисимовым)

1 Р. 1953; советский (российский) и британский химик, молекулярный биолог, бактериолог. Сконструированный им (с колл.) банк генов в E. coli из расфракционированной на хромосомную и плазмидную составляющие ДНК штамма Y. pestis EV позволил получить клон E. coli, синтезирующий капсульный антиген. Дальнейшие исследования показали, что образование капсулы контролируется генами caf- оперона (от англ. capsular antigen fraction). Примечательно, что результаты этих исследований, опубликованные в 1990–1992 годах, опровергли существовавшее в то время предположение, будто бы гены, ответственные за синтез капсульного антигена, располагаются на хромосоме (напомним: они «обитают» на плазмиде pFra). Всё это стало возможно благодаря созданному космидному вектору pHC79, который позволил клонировать (внести в E. coli) большие фрагменты генома, что весьма критично, поскольку для синтеза капсульного антигена необходимо наличие и экспрессия целого кластера генов.

491

Секвенирование штаммов позволяет изучать эволюцию чумного микроба, строить филогенетические деревья, о которых говорили в самом начале (Глава 3), а также объяснять ферментативные особенности некоторых штаммов и развивать подходы к внутривидовой дифференциации.

В1998 году для типирования микроорганизмов было предложе-

но 1 мультилокусное секвенирование (MLST, multilocus sequence typing), в основе которого лежит анализ вариабельности (т. е. изменчивости) консервативных генов, то есть тех генов, которые медленнее других накапливают мутации (их ещё называют генами «домашнего хозяйства»). В качестве мишеней чаще всего выбирают гены, по которым определяют филогенетическое родство, но которые не кодируют факторы вирулентности и патогенности. Чаще всего в качестве таких генов используют rha-локус, aspA и nap.

Вотличие от MLST, требующего обязательного секвенирования генов-мишеней, анализ полиморфизма единичных нуклеотидов (SNP, single nucleotide polymorphism), при котором оценивают вариабельность единичных нуклеотидов определённого локуса гено-

ма (так называемый однонуклеотидный полиморфизм), позволяет проводить дифференциацию микроорганизма с помощью более простых методов, таких как, например, ПЦР в реальном времени. Так, например, для штаммов чумного микроба основных и неосновных подвидов были обнаруженны специфические SNP, к которым подобраны соответствующие праймеры2. С другой стороны, многими исследователями SNP-типы используются для внутривидовой дифференцировки и уточнения филогении3, о чём упомина-

1Maiden M. C., Bygraves J. A., et al. Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. PNAS. 1998; 95(6):3140– 3145; DOI: 10.1073/pnas.95.6.3140.

2Kislichkina A. A., Kadnikova L. A., et al. Differentiation of Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis subsp. pestis and subsp. microti strains and other representatives of Yersinia pseudotuberculosis

complex. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2017; 32(2):67–74; DOI: 10.3103/S0891416817020070.

3 Например, у штаммов подветви 0.PE5/1 обнаружены замена Т → А в позиции 54674 гена ligB, замена T → G в позиции 172494 гена cysG и замена А → С в позиции 4425839 гена glgA. У штаммов подветви 0.PE5/2–1 обнаружены замена С → А в позиции 3081204 гена sixA и замена G → A в позиции 4413306 гена argE. У штаммов подветви 0.PE5/2–2 обнаружены замена T → G в позиции 353703 гена YPO0344 и замена С → А в позиции 2580558 гена YPO2295.

492

лось в Главе 3 (возможно, при первом знакомстве эта глава показалась сложной и непонятной; прочтите же её снова с учётом уже имеющихся знаний!).

Помимо вариабельности генов, изучают вариабельность так называемых тандемных повторов (tandem repeat), то есть повторяющихся друг за другом участков ДНК. Мультилокусное VNTR-

типирование (MLVA, multiple locus VNTR analysis) основано на изу-

чении тандемных повторов, отличающихся по числу повторов (VNTR, variable number tandem repeat), а именно на ошибках, возникающих в процессе репликации VNTR. Для этого амплифицируют известные локусы c помощью ПЦР и сравнивают вариабельность VNTR с эталоном. Таким образом, к настоящему моменту выявлено уже более 430 MLVA25 типов.

Существуют также иные методы типирования, но не все они применяются в случае чумного микроба. Так, достаточно популярное определение полиморфизма рибосомных РНК (рРНК), в частности 16S рРНК, не показательно для чумного микроба из-за совпадения с Y. pseudotuberculosis. Более того, из трёх основных типов рРНК (23S и 5S в большой субъединице, и 16S в малой субъединице) обнаружена разница только по одному нуклеотиду в последовательности генов 23S рРНК!

Все эти методы позволяют изучать микроэволюцию чумного микроба, чтобы строить филогенетические деревья, о которых мы говорили в самом начале этой книги (Глава 3) или проводить филогеографические исследования, а в практической эпидемиологии – строить маршруты распространения эпидемии (Рис. 36.5).

493

Рис. 36.5.

Карта распространения штаммов сублинии 2 во время эпизоотического процесса в Юньнаньском равнинном очаге в Китае (а) и фило-

генетические деревья (b, c) двух основных геновариантов (SNP типов). Синий пятиугольник обозначает вероятный регион «начала» эпизоотии, а красные стрелки указывают на прямые (сплошные стрелки) и косвенные (пунктирные стрелки) маршруты распространения. Кружи обозначают количество штаммов, группы которых обозначены цветом. Цвета линий филогенетических деревьев указывают на места отбора проб (по

Qin J., 2023)

494

К настоящему моменту мы рассмотрели методы, которые чаще всего применяются на практике для лабораторной диагностики чумы. Окончательный положительный ответ всегда даётся на основании идентификации выделенной чистой культуры, однако по ходу исследования могут быть даны как предварительные положительные, так и отрицательные ответы. Порядок лабораторного исследования и его сроки1 устанавливаются нормативными документами, но чаще всего они бывают следующими.

Материал от больных, свободный от посторонней микрофлоры (кровь, сыворотка крови, пунктаты бубона)

1 Говоря о сроках, следует воспринимать их исключительно как минимальное время, за которое возможно провести данный этап исследования, но которое не включает в себя различных форс-мажорных обстоятельств и последовательного поступления проб. Сроки – это такое явление, которым крайне часто любят тыкать начальники в сотрудника, непосредственно выполняющего исследование. Если вы оказались в этой ситуации, следует спокойно объяснить, что любое исследование может закончиться невалидным результатом, требующим перестановки, а также, что для работы с пробой, помимо подготовки необходимых растворов и инструментария, её саму необходимо зарегистрировать, распаковать и подготовить, что порой требует очень много времени, не заложенного в расчётные сроки.

495

496

–ИХА;

–тест на подвижность;

–проба с бактериофагом;

–реакция агглютинации;

–тест на ферментативную активность;

–тест на синтез FI (при 37°С);

–ПЦР/LAMP (в том числе с бактериофагом);

–определение чувствительности к антибиотикам (дискодиффузионный метод).

497

–морфология роста колоний и в бульоне;

–микроскопия + МФА;

–ИХА;

–тест на подвижность;

–проба с бактериофагом;

–реакция агглютинации;

–тест на ферментативную активность;

–тест на синтез FI (при 37°С);

–ПЦР/LAMP (в том числе с бактериофагом);

499