Опера о чуме (учебник)

Му ллисом1 , получив название полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR, от англ. polymerase chain reaction). Суть ПЦР сводится к трём этапам:

1.Денатурация (плавление). Фрагмент ДНК (ДНК-матрицу)2 нагревают до температуры 95°С (полминуты), чтобы в результате разрушения водородных связей разошлись две комплементарные цепи ДНК.

2.Отжиг праймеров. В результате снижения температуры примерно до 60°С (20–30 секунд), что зависит от праймеров (коротких синтетических олигонуклеотидов длиной 18–30 оснований), последние связываются с комплементарными фрагментами на цепочках ДНК. Именно от праймеров зависит специфичность ПЦР, поэтому их подбирают к наиболее уникальному и в то же время консервативному участку ДНК, чтобы при возникновении мутаций не пришлось создавать новые праймеры и не получить ложноотрицательный результат.

3.Элонгация. Температуру повышают до 70°С, чтобы фермент ДНК-зависимая ДНК-полимераза достроила из дезоксинуклеозидтрифосфатов («строительных блоков») вторую цепь, начиная от 3’-конца праймера, используемого в качестве затравки.

Режим температуры обеспечивается специальным прибором –

термоциклером (thermocycler) или амплификатором (DNA amplifier).

Таким образом, в теории в результате одного цикла из одного исходного фрагмента ДНК образуется два фрагмента, содержащих целевую область (т. к. достройка идёт от праймеров), следовательно, при многократном повторении количество продукта реакции (т. е. новых фрагментов ДНК, содержащих целевую область, или апликóнов) увеличивается в геометрической прогрессии. На практи-

1Kary Banks Mullis; 1944–2019; американский биохимик. Лауреат Нобелевской премии по химии (1993). Отличался противоречивыми научными взглядами, в частности, отрицал изменение климата, истощение озонового слоя и связь между ВИЧ и СПИДом, объясняя свою позицию заговором; верил в астрологию.

2Если целевым продуктом является РНК, то до стадии денатурации проводят обратную транскрипцию, то есть добавляют к РНК фермент РНК-зависимую ДНКполимеразу (ревертазу) и нагревают при 50°С, что приводит к образованию кДНК, которая и участвует в ПЦР.

480

ке выход продукта обычно ниже 100%, поэтому математически процесс ПЦР выражается как (1 + Е)n, где Е – средняя эффективность реакции, n – количество циклов.

Первое время на каждом цикле после первого этапа приходилось добавлять ДНК-полимеразу, поскольку она инактивировалась при высокой температуре. Это делало процесс сложным, долгим и недешёвым. Поэтому уже в 1988 году было предложено 1 вместо полимеразы из бактерий Escherichia coli использовать полимеразу из термофильных бактерий Thermus aquatiqus, именуемую Taqполимеразой и охарактеризованную за 10 лет до этого2. Существенным недостатком Taq-полимеразы является достаточно высокая вероятность внесения ошибочного нуклеотида из-за отсутствия механизма исправления ошибок. Полимераза Pfu, выделенная 3 в 1991 году из гипертермофильного архея Pyrococcus furiosus, обладает таким механизмом, но имеет низкую скорость работы, поэтому в настоящее время применяют смесь из Taq-полимеразы (для быстрой работы) и Pfu-полимеразы (для исправления ошибок). Стоит отметить, что при более низких температурах, например, при комнатной температуре, возможно неспецифическое действие полимеразы, что приводит к слипанию праймеров и образованию димеров. Поэтому уже в 1994 году было предложено4 использовать антитела для инактивации полимеразы. Данная модификация, названная ПЦР с горячим стартом (Hot start PCR), предполагает «освобождение» полимеразы от антител на дополнительном этапе инактивации, проводимом перед денатурацией и включающем нагрев до 96–98°С (от 5 до 15 минут).

1 Saiki R. C., Gelfand D. H., et al. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science. 1988; 239(4839):487–491; DOI: 10.1126/science.2448875.

2 Chien A., Edgar D. B., et al. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol. 1976; 127(3):1550–1557; DOI: 10.1128/jb.127.3.15501557.1976.

3 Lundberg K. S., Shoemaker D. D., et al. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene. 1991; 108(1):1–6; DOI: 10.1016/0378- 1119(91)90480-Y.

4 Sharkey D. J., Scalice E. R., et al. Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction. Nature Biotechnology. 1994; 12(5):506–509; DOI: 10.1038/nbt0594-506.

481

Постановку ПЦР осуществляют в боксированном помещении ПЦР-лаборатории1, разделённой на последовательно расположенные рабочие зоны: разбора и первичной обработки материала (рабочая зона 1), выделения нуклеиновых кислот (рабочая зона 2), проведения реакции амплификации (рабочая зона 3)2. Учёт результатов, в зависимости от метода, проводят в рабочих зонах 3 или 4. Рекомендуется разделять рабочую зону 3 на два помещения (подзоны 3а и 3б), размещая их в отдельных помещениях. В подзоне 3а осуществляют приготовление реакционных смесей и, при необходимости, проведение обратной транскрипции. В подзоне 3б проводят амплификацию нуклеиновых кислот.

Для детекции результатов амплификации проводят электрофо-

рез (Gel electrophoresis of nucleic acids), рабочая зона 4–1, когда про-

дукты амплификации 3 окрашивают специфичным красителем, чаще всего бромистым этидием (3,8-диамино-5-этил-6-фенил- фенантридиум бромид), и помещают в агарозный гель (0,7–2%-ный раствор агарозы в буфере), где под действием внешнего электрического поля наработанные фрагменты ДНК мигрируют от отрицательно заряженного катода к положительно заряженному аноду. Поскольку молекулы разной массы будут мигрировать с различной скоростью, через некоторое время они окажутся в разных частях геля, что благодаря красителю, флуоресцирующему под действием ультрафиолета, можно будет увидеть в виде полос4 (Рис. 36.1). Для

1После работы помещения, бокс и инструментарий обрабатываются раствором дезинфектанта, в качестве которого используют 3%-ный раствор пероксида водорода или хлорсодержащие вещества (например, 0,2%-ный раствор ДП-2Т). Использование для этих целей растворов этилового спирта не допускается!

2При необходимости возможно совмещение рабочих зон 2 и 3 в одном помещении при условии работы в БМБ не ниже II класса для каждого этапа.

3Работать с ними следует крайне аккуратно, чтобы не законтаминировать рабочее место!

4Похожим образом определяют наличие плазмид в исследуемой культуре. Для этого из выращенной на агаре в течение 1-2 суток культуры выделяют ДНК: культуру эмульгируют в 100 мкл литической смеси (50 mM Tris, 3% SDS; довести рН до 12,6 прибавлением 2 моль/л NaOH), добавляют 10 мкл лизоцима и прогревают 30 минут на водяной бане при температуре 60°С. Затем добавляют 100 мкл фенолхлороформной смеси (концентрация 1:1), быстро (но бережно!) встряхивают и центрифугируют 15 минут при 6000 об/мин. Аккуратно отбирают верхнюю фазу, не задевая интерфазу и осадок. Можно использовать и коммерческие наборы. Далее окрашивают специфичным красителем (например, бромистым этидием) и наносят на 0,7-0,75% гель для электрофореза, который проводят на ТАЕ-буфере (рН 7,8-7,9).

482

того, чтобы понимать, какая длина фрагмента полученного продук-

та, в щель дополнительно вносят маркеры размера молекулярной мас-

сы (molecular-weight size marker), именуемые также ДНК-лестницей

(DNA ladder)1.

Для детекции в режиме реального времени (ПЦР-РВ, real time PCR), рабо-

чая зона 3 (подзона 3б), чаще всего используют ДНК-зонды с флуоресцирующей меткой (флуорофором) и гасителем, комплементарные продук-

ту амплификации (гибридизационноферментный метод детекции). По-

скольку метка и гаситель пришиты к зонду, сигнал от метки поглощается гасителем, однако во время амплификации целостность зонда нарушается, и метка «выходит» в реакционную смесь, где её «встреча» с гасителем маловероятна. Чаще всего это происходит на этапе элонгации. Детекция осуществляется путём возбуждения флуорофора лазером и регистрацией испускаемой длины волны после каждого цикла, следовательно, интенсивность возбуждения с каждым циклом будет расти. И поскольку ПЦР по сути является реакцией полимеризации, где идентифицируемый фрагмент ДНК является своеобразным мономе-

ром реакции, то кинетика процесса (график амплификации) будет иметь характерную S-образную форму: базовую линию, экспоненциальный рост и плато (Рис. 36.3).

На электрофореграмме (Рис. 36.2) должны визуализироваться три полосы плазмидной ДНК, соответствующие pCad (47 МД), pFra (60-100 МД) и pPla (6-8 МД). Удобнее всего сравнивать с электрофореграммой ДНК, выделенной из контрольного штамма.

1 Измеряют в Дальтонах (Да, D), чаще мегадальтонах (МД, МДа, Md), и парах нуклеотидов (базах).

483

Рис. 36.3. График амплификации с зарегистрированными сигналами (кривыми по каналам детекции), соответствующими фрагменту хромосомной нуклеотидной последовательности hmsH, фрагменту хромосомного гена YPO2088 (кодирует метилтрансферазу) и специфическому фрагменту нуклеотидной последовательности YPPCP1.09c видоспецифичной плазмиды pPla, а также внутреннему контролю образца (ВКО). Положительные контроли для наглядности опущены, горизонтальные линии – пороговая линия. Наличие сигналов по трём каналам (hmsH, YPO2088, pPla) указывает на содержание в пробе ДНК высоковирулентного, эпидемически значимого штамма чумного микроба. Наличие только двух сигналов (hmsH и pPla) указывает на содержание в пробе ДНК чумного микроба со сниженной эпидемической значимостью, а наличие только сигнала YPO2088 – авирулентного штамма чумного микроба

ных плазмид. Интересен в качестве мишени ген YP_002346399.1,

кодирующий ftsK/SpoIIIE family protein1, поскольку в позиции 3056

гена у штаммов основного подвида находится аденин, тогда как у штаммов неосновного подвида – гуанин, что позволяет2 на отличии всего одного нуклеотида различать штаммы основного подвида от штаммов неосновных подвидов. Кроме того, для целей внутривидовой дифференцировки разрабатываются тест-системы, основан-

1 Данный белок предположительно связан с сегрегацией ДНК (т. е. распределе-

нием элементов её генетического материала в дочерние клетки).

2 Трухачёв А. Л., Коновалова Н. В., и др. Выявление SNP-маркеров и конструирование набора реагентов для внутривидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis в ПЦР с помощью аллель-специфических зондов, в сборн. Сборник трудов IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, под ред. В. И. Покровского, Т. 1. Тамбов:

ООО фирма «Юлис», 2017, 554 с.

485

ные на амплификации фрагментов видоспецифичных участков хромосомы. Так, например, для улегейских штаммов характерна делеция в гене АК38_1098 (в 88 п. н.), а для алтайских штаммов – в гене АК38_1327 (в 90 п. н.). Созданные1 на эти делеции праймеры позволяют идентифицировать указанные штаммы методом ПЦР. Для дифференциации авирулентных штаммов основного подвида от вирулентных выявляют, как несложно догадаться, хромосомные гены hmsH (hms-локус области пигментации) и irp2 (остров высокой патогенности области пигментации), а также ген lcrV плазмиды pCad (подробно об этих генах говорилось в Главе 6).

ПЦР является быстрым и высокочувствительным методом, позволяющим детектировать 102–103 копий/мл материала. Он особенно удобен в ситуации, когда бактериологическое исследование затруднено (выделение чистой культуры маловероятно или вообще невозможно), а также для экспресс-диагностики. Вместе с тем ПЦР, как и все молекулярно-генетические методы, позволяет ответить только на вопрос, есть или нет нуклеиновая кислота в образце, а не живой ли микроорганизм. И это очень важно понимать, поскольку в случае бактерий наличие положительного результата ПЦР ещё не является доказательством наличия возбудителя, однако с помощью ПЦР можно дать предварительный результат, а также обнаружить факторы вирулентности.

С другой стороны, с помощью ПЦР можно косвенно подтвердить наличие живых клеток возбудителя в образце, используя литические бактериофаги. Зная начальную концентрацию бактериофагов, по увеличению их титра на ПЦР с течением времени (например, через 30, 60 и 90 минут) можно судить о наличии живых клеток возбудителя в материале. В случае чумного микроба было предложено2 использовать бактериофаги Л-413С и ϕ1122, однако следует помнить, что при более высокой специфичности первого его литический цикл (т. е. время от заражения бактериальной клет-

1 Никифоров К. А., Оглодин Е. Г., и др. Подвидовая дифференциация штаммов Yersinia pestis методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 2:22–27; DOI: 10.36233/0372-9311-2017-2-22-27.

2 Sergueev K. V., He Y., et al. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by Real-Time PCR, PLoS One. 2010; 5(6):e11337; DOI: 10.1371/journal.pone.0011337.

486

ки до выхода фаговых частиц) составляет 90 минут, тогда как у второго за это время проходит три литических цикла. Таким образом, в случае бактериофага Л-413С будет наработано 115 фаговых частиц, а в случае ϕ1122 – примерно 105. Данный способ достаточно простой и позволяет получить результат за 4 часа, однако, как уже не раз говорилось, необходимо помнить о фагоустойчивости и специфичности бактериофагов.

В качестве сравнительно быстрой (5–30 минут) альтернативы ПЦР применяют разработанную1 в 2000 году петлевую изотермиче-

скую амплификацию (LAMP, loop-mediated isothermal amplification).

Проводят LAMP при постоянной температуре (60–65°С), а результат амплификации детектируют либо визуально, по выпавшему в осадок пирофосфату магния (осадок), либо фотометрически (в режиме реального времени). Используют четыре праймера (FIP, F3, BIP и B3), распознающие в общей сложности шесть различных последовательностей целевой ДНК (Рис. 36.4), и ДНК-полимеразу из термофильной бактерии Bacilus stearothermophilus – Bst-полимеразу.

Участок F2 праймера FIP связывается с комплементарным участком F2c одной цепи ДНК, в результате чего ДНК-полимераза достраивает цепь (1), вытесняя вторую цепь исходной ДНК. Далее праймер F3 связывается с комплементарным участком F3c исходной цепи ДНК, в результате чего ДНК-полимераза снова достраивает цепь (2), а достроенная ранее цепь (1) вытесняется и 5'-концом «сворачивается» в петлю (F1 – F1c). К этой цепи (1) подходит праймер BIP и участком В2 связывается с комплементарным участком В2с. ДНК-полимераза достаивает цепь (3). Праймер В3 связывается с комплементарным участком В3с цепи (1), ДНК-полимераза достраивает цепь (4), которая вытесняет цепь (3), в результате чего последняя (3) «сворачивается» в две петли на концах, образуя конкатемер (целевой фрагмент). В результате построения множества инвертированных конкатемеров формируются в пространстве структуры, похожие на цветную капусту (cauliflower-like structures).

1 Notomi T., Okayama H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 2000; 28(15):e63; DOI: 10.1093/nar/28.12.e63.

487

488

◄Рис. 36.4. Краткая схема LAMP и используемые в ней праймеры:

FIP – прямой внутренний праймер, состоящий из частей F1c (5’) и F2 (3’), комплементарных участкам F1 и F2c; BIP – обратный внутренний праймер, состоящий из частей B1c (5’) и B2 (3’), комплементарных участкам В1 и В2с;

F3 – прямой наружный праймер, комплементарный к участку F3c; В3 – обратный наружный праймер, комплементарный участку В3с

Чуть позже было предложено1 использовать шесть праймеров, распознающих восемь целевых участков, что, как несложно догадаться, повышает специфичность. Вместе с тем большое количество праймеров определяет главную сложность создания тест-систем2. Применительно к Y. pestis разработаны3 тест-системы LAMP чувствительностью 104 копий/мл, с праймерами на хромосомный участок 3а и ген caf1A, плазмиды pFra. Способа определения возбудителя по титру бактериофага для LAMP не предложено, но теоретически это также возможно.

Быстрое обнаружение ДНК чумного микроба не единственная задача, которую можно решать с помощью молекулярногенетических методов. Проникнуть в строение ДНК, чтобы проследить микроэволюцию, – вот где высший пилотаж!

В 1977 году Фредери ком Сéнгером4 (с колл.) был предложен5 метод определения последовательности нуклеотидов ДНК путём обрыва цепи, названный секвенирование по Сенгеру. Суть метода заключается в том, что к четырём образцам, содержащим фрагменты одной цепочки ДНК6, помеченные с одного конца радиоактивным изотопом, добавляют ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифос-

1Nagamine K., Hase T., et al. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002; 16(3):223–229; DOI: 10.1006/mcpr.2002.0415.

2Чаще всего для подбора праймеров используют компьютерные программы,

например, PrimerExplorer (www.primerexplorer.jp).

3 Singh R., Pal V., et al. Development of a pair of real-time loop mediated isothermal amplification assays for detection of Yersinia pestis, the causative agent of plague. Mol Cell Probes. 2020; 54:101670; DOI: 10.1016/j.mcp.2020.101670.

4 Frederick Sanger, 1918–2013; британский биохимик. Дважды Лауреат Нобелевской премии по химии (1958, 1980). Определил аминокислотный состав инсулина и других белков.

5Sanger F., Nicklen S., et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS. 1977; 74(12):5463–5467; DOI: 10.1073/pnas.74.12.5463.

6Со времени создания ПЦР, фрагменты нарабатывают аплификацией.

489