Опера о чуме (учебник)

410

Табл. 31.2. Биохимические тесты для

Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica

Далее поговорим о дополнительных исследованиях, проводимых для окончательной идентификации чумного микроба и дифференциации его подвидов (Табл. 31.4).

Определение чувствительности к пестицину проводят методом отсроченного антагонизма. На поверхность 1,5%-ного агара Хоттингера в центре чашки с помощью петли бляшкой наносят суточную культуру штамма Y. pestis, продуцирующего пестицин (т. е. имеющего плазмиду pPla) и инкубируют при температуре 28°С в течение 48–72 часов. На крышку чашки (напомним: чашка размещается крышкой вниз) кладут фильтровальную бумагу или тампон, смоченные хлороформом, для стерилизации культуры. Через час-два тампоны удаляют и просушивают чашку, приоткрыв крышку (хотя культура и стерилизованная, технику работ с ПБА лучше не нару-

411

шать), до полного исчезновения запаха хлороформа. Затем на поверхность агара наносится (выливается) 4,5 мл 0,7%-ного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40–47°С, и содержащего 0,5 мл четырёхчасовой бульонной культуры исследуемого штамма. Посевы инкубируют при температуре 28°С. При положительном результате, если исследуемый штамм проявляет чувствительность к пестицину, в центре чашки (вокруг колоний штаммапродуцента) будет наблюдаться задержка роста культуры.

Определение пестициногенности (способности синтезировать пес-

тицин) проводят обратным методом. На поверхность 1,5%-ного агара Хоттингера в центре чашки с помощью петли бляшкой наносят культуру исследуемого штамма и инкубируют при температуре 28°С в течение 48–72 часов. На крышку чашки кладут фильтровальную бумагу или тампон, смоченные хлороформом, для стерилизации культуры. Через час-два тампоны удаляют и просушивают чашку, после чего на поверхность агара наносится (выливается) 4,5 мл 0,7%-ного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40–47°С, и содержащего 0,5 мл четырёхчасовой бульонной культуры чувствительного к пестицину штамма. Посевы инкубируют при температуре 28°С. При положительном результате, если исследуемый штамм проявляет пестициногенность, в центре чашки (вокруг колоний штамма-продуцента) будет наблюдаться задержка роста культуры.

Определение плазмокоагулазной активности. В 0,5 мл плазмы кро-

ви1 вносят одну петлю суточной (реже двухсуточной) культуры. В качестве положительного контроля используют штамм Y. pestis, содержащий плазмиду pPla (например, штамм Y. pestis EV), а в качестве отрицательного контроля – чистую плазму. Посевы и контроли инкубируют при температуре 28°С.

Учёт результатов проводят через каждый час, начиная с положительного контрольного образца (отрицательный контрольный образец должен оставаться жидким). Как правило, сгусток крови

1 Используют цитратную кроличью плазму; допускается использование очищенного препарата фибриногена, растворённого в физиологическом растворе до концентрации 10 мг/мл. Следует отметить, что рядом специалистов рекомендовано использование цельной нативной человеческой плазмы крови, однако в ряде стран это запрещено законом о донорстве крови и её компонентов.

412

образуется уже через 1–2 часа, однако наблюдения продолжают в течение 24 часов (в случае использования препарата фибриногена – в течение 48 часов), за которые сгусток должен образоваться и начать уменьшаться в размерах вследствие фибринолиза. Оценку результатов проводят по системе четырёх крестов:

Положительная реакция наблюдается, как правило, у всех штаммов, за исключением кавказских.

Определение фибринолитической активности. В плазму крови вно-

сится физиологический раствор до концентрации 1:8 (реже 1:101) и разливается в пробирки по 0,5 мл. Затем готовится взвесь суточной культуры, содержащей 1 х 109 м.к./мл (т. е. микробных клеток в мл), для чего её петлёй вносят в пробирку с физиологическим раствором (наносят на стенку у самой кромки раствора и круговыми движениями аккуратно «смывают» в раствор). Для получения заданной концентрации целесообразнее внести одну-две петли в небольшое количество физиологического раствора, после чего развести полученную концентрированную взвесь физиологическим раствором. Контроль концентрации осуществляют путём сравнения

1 Выбор разведения осуществляется путём постановки исследования с контрольным штаммом (например, Y. pestis EV), при котором образующийся сгусток фибрина будет полностью растворяться к 18–20 часу.

413

полученного раствора со стандартом мутности МакФáрланда1 или отраслевого стандартного образца (ОСО)2, калиброванного в соответ-

ствии с Международным стандартом мутности образцов3. В пробирку с плазмой вносится 0,25 мл полученной взвеси, после чего перемешивается и добавляется 0,1 мл 0,5%-ного раствора хлорида кальция. В качестве положительного контроля используют штамм Y. pestis, содержащий плазмиду pPla (например, штамм Y. pestis EV), а в качестве отрицательного контроля – чистую плазму с растворами хлорида кальция (0,25 мл 0,9%-ного раствора и 0,1 мл 0,5%- ного раствора). Посевы и контроли инкубируются при 37°С.

Через 40–60 минут проверяется образование сгустка (если он не образовался, то исследование повторяют), а учёт результатов проводят через 18–20 часов. Оценку результатов проводят по системе четырёх крестов:

–

наблюдается только сгусток фибрина (без жидкой плазмы)

1Предложен в 1907 году Джозефом МакФарландом и готовится путём смешения 1%-ного раствора серной кислоты с 1,175%-ным раствором дигидрата хлорида бария, в результате чего образуется сульфат бария (см. McFarland J. The nephelometer: an instrument for estimating the numbers of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J Am Med Assoc. 1097; 49:1176–1178).

2Представляет собой взвешенные в дистиллированной воде частицы боросиликатного стекла (Pyrex®) диаметром 0,5–3,5 мкм. Стандарты выпускаются плотностью 5 МЕ и 10 МЕ, что для чумного микроба соответствует концентрациям 4,75 х 106 и

0,95 х 109 м.к./мл соответственно.

3 5th International reference preparation of opacity, WHO International Standard, NIBSC code 76/522, Version 6.0 (2013), 2 p.

414

Если необходимо дать количественную оценку фибринолитической активносити, то данное исследование проводят со взвесями 1 х 109, 1 х 108, 1 х 107 и так далее. Для получения взвесей 0,5 мл исходной взвести (1 х 109 м.к./мл) вносят в пробирку с 4,5 мл физиологического раствора, получая таким образом первое разведение (10- 1), которое содержит 1 х 108 м.к./мл1. Затем 0,5 мл раствора из пробирки с первым разведением вносят в пробирку с 4,5 мл физиологического раствора, то есть получают второе разведение (10-2), содержащее 1 х 107 м.к./мл. Продолжая описанные манипуляции, получают необходимые разведения и концентрации. Данный про-

цесс именуется титрованием бактериальной культуры.

Схема метода приведена в Табл. 31.3. «Читают» её сверху вниз по строчкам (до двойной сплошной линии, после которой даны пояснения по концентрациям). Стрелка «→» указывает на перенос указанного над ней объёма (в данном случае 0,5 мл) в следующую пробирку, стрелка «↑» – на удаление указанного рядом с ней объёма (в данном случае 0,1 мл) из пробирки на чашку. Цифра без стрелки обозначает вносимый объём.

Табл. 31.3. Схема титрования для количественной оценки фибринолитической активности

Определение признака пигментсорбции, то есть способности бак-

терией сорбировать кислые красители и гемин, позволяет определить наличие важного фактора вирулентности – хромосомную область пигементации. Проводят исследование на среде Джексона –

1 Возможно внесение 1 мл исходной взвеси в 9 мл физиологического раствора.

415

Берроуза с гемином. На поверхность среды пипеткой наносят 0,1 мл взвеси суточной культуры в физиологическом растворе, содержащей 5 х 103 м. к./мл, и равномерно распределяют шпателем по поверхности агара. В качестве отрицательного контроля используют pgm– штаммы (например, штамм Y. pestis EV). Посевы инкубируют 5–10 суток при 28°С.

Вирулентные штаммы (pgm+), как правило, вырастают в виде небольших чёрно-бурых колоний, а авирулентные штаммы (pgm–) – в виде крупных бесцветных колоний.

Признак пигментсорбции возможно выявить и на агаре Хоттингера. Для этого к агару следует добавить 0,05 мг/мл красителя конго красного, после чего нанести 0,1 мл взвеси суточной культуры в физиологическом растворе, содержащей 5 х 103 м.к./мл, равномерно распределить по поверхности агара шпателем и инкубировать 1–2 суток при 28°С и 2–3 суток при 4°С.

Вирулентные штаммы (pgm+) вырастают в виде красных колоний, а авирулентные штаммы (pgm–) – в виде бесцветных колоний.

Следует помнить, что штаммы Y. pseudotuberculosis О1 серотипа также обладают признаком пигментсорбции, а сравнение нуклеотидных последовательностей hms-оперона двух видов показало1, что хотя эволюционный процесс и сопровождался единичными нуклеотидными заменами во всех генах оперона, практически все они образовали лишь кодоны синонимы. Так, замена в 603 позиции гуанина на аденин (G→A) в гене hmsH привела к изменению три-

плета ACG у Y. pseudotuberculosis на триплет АСА у Y. pestis, но не повлияла на синтез аминокислоты (треонина). Даже замена G→A в позиции 612 (GAC612/GAA612) в том же гене привела только к замене одной отрицательно заряженной аминокислоты (изолейцина) на другую (валин). Тем не менее признак пигментсорбции можно использовать для дифференциальной диагностики. Для этого чумной микроб выращивают на среде HmsD (от англ. hemin-storage phenotype differentiation), а псевдотуберкулёзный – на среде

HmsDpstbc (при 15°С).

1 Булгакова Е. Г., Краснов Я. М., и др.Особенности проявления признака пигементации и структурные различия генов hms-оперона у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis разного проис-

хождения. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 2:30–35.

416

Рис. 31.5. Колонии чумного и псевдотуберкулёзного микробов на средах HmsD и HmsDpstbc (по Е. Г. Булгакова, 2011):

1 – алтайский и улегейский штамм; 2 – кавказский штамм; 3 – таласский штамм; 4 – гиссарский штамм; 5 – штамм основного подвида

(так называемая «яичница»); 6 – штамм Y. pseudotuberculosis 338Д (О1 серотип), 7 – штамм Y. pseudotuberculosis A17 (О1 серопит)

Штаммы основного подвида чумного микроба (5) образуют зернистые колонии, интенсивно окрашенные, с волнистым бесцветным краем, тогда как алтайские (1), гиссарские (4), таласские (3) и улегейские (1) штаммы образуют рыхлые, менее окрашенные, почти розовые колонии. Кавказские штаммы (2) образуют наиболее плотные, с ровным краем и ярко окрашенные колонии. Штаммы псевдотуберкулёзного микроба (6 и 7) образуют гладкие колонии, чуть менее интенсивно окрашенные, а также колонии смешанного типа, имеющие как пигментированные, так и непигментированные сегменты (Рис. 31.5).

Зависимость роста от ионов кальция исследуют на агаре Хигучи – Смита. Из выращенной в течение 18–24 часов при 28°С культуры готовят взвеси в физиологическом растворе, содержащие 1 х 103, 1 х 104 и 5 х 105 м. к./мл, которые по 0,1 мл высевают на чашки с агаром.

417

Посевы инкубируют 48 часов при 37°С и проводят подсчёт колоний (авирулентных кальцийнезависимых). Далее инкубируют 24 часа при 28 °С и проводят подсчёт новых колоний (вирулентных кальцийзависимых)1.

В качестве контролей используют культуры, содержащие и не содержащий плазмиду рCad, посеянные такими же взвесями по 0,1 мл на агар Хоттингера, содержащий 5 % крови.

Табл. 31.4. Дифференциальные тесты для

Y. pestis и Y. pseudotuberculosis 01

Бельгия, 1921 год. В обширном зале проходит очередное заседание Биологического общества, собравшее большое количество учёных мужей и зрителей, среди которых можно видеть уже известного нам человека, пристально наблюдающего за яростным спором

1 В случае инкубации посевов 71 час при 37°С, вырастают колонии трёх типов: крупные (2–2,5 мм), средние (1,5–2 мм) и очень мелкие (менее 1 мм). Крупные и средние колонии сформированы кальцийнезависимыми клетками.

418

Жю ля Бордé1 и Ришáра Брюинóга2. Каждый из них вместе со своей группой старается доказать оппоненту, что именно его понимание сущности бактериофага – истина. Для первого бактериофаг не более чем нормальная функция бактерий, связанная с мутациями, тогда как для второго это вирус! Чтобы понять точку зрения Жюля Борде, нужно помнить, что он занимался исключительно вопросами иммунитета и даже не думал о бактериофагах. Однако после того как Феликс д’Эрелль, разочарованный в неэффективности вакцин, применяемых во время Первой мировой войны (вероятно изза спешки страдал контроль), обрушился с критикой на иммунологию и лично Жюля Борде, последний приложил все усилия для того, чтобы доказать несостоятельность идей д’Эрелля.

Но вернёмся на собрание. В этот раз одним из оппонентов Жюля Борде стал Ренé Аппельмáн, предложивший3 метод предельных разведений, который показывает, что при внесении одинакового количества бактерий в пробирки с последовательными разведениями бактериофага, лизис наблюдается лишь в части пробирок, что свидетельствует в пользу существования бактериофага как частицы – вируса.

Метод Аппельмана позволяет узнать титр бактериофага, вызывающий полный лизис бульонной культуры. Для этого в десять пробирок разливают по 4,5 мл бульона (одну подписывают как «контроль», а остальные номеруют от 1 до 9). В первую пробирку вносят 0,5 мл бактериофага, тщательно перемешивают и переносят 0,5 мл во вторую, и так продолжают до девятой пробирки, которая соответствует девятому разведению (можно видеть, что данный процесс аналогичен титрованию бактериальной культуры). В отдельной пробирке готовят суспензию бактериальной культуры (примерно 109 м. к./мл) и вносят по 0,05 мл (одна капля) во все десять пробирок. Инкубируют посевы в случае чумного микроба при 28°С, периодически просматривая и фиксируя прозрачность в пробирках с разведениями бактериофага относительно контроля. Пробирка с тем разведением бактериофага, которая предшествует раз-

1Jules Jean-Baptiste Vincent Bordet, 1870–1961; бельгийский врач, бактериолог,

иммунолог. Лауреат Нобелевской премии по медицине или физиологии (1919).

2Richard Bruynoghe, 1881–1957; бельгийский врач, бактериолог.

3Appelmans R. Le dosage du bactériophage. Compt Rend Soc Biol. 1921; 85:701.

419