Опера о чуме (учебник)

Рис. 30.8. Колонии патогенных для человека представителей рода Yersinia:

Y. enterocolitica (a), Y. pseudotuberculosis (b) и Y. pestis (c) на агаре. В нижнем ряду показаны отдельные колонии Y. enterocolitica патогенных серотипов O:3 (d) и О:5,27 (е), непатогенного серотипа ВТ1А (f), а также бывших биовариантов 3А и 3В – Y. bercovieri (g) и Y. mollaretii (h). Обратите внимание на характерный для

Y.enterocolitica О:3 вид колонии «бычий глаз», а также визуальное сходство коло-

ний Y. enterocolitica О:5,27 и Y. bercovieri (нижний ряд по Hallanvuo S., 2006;

публикуется по лицензии The American Society of Microbiology, разрешение пере-

дано через Copyright Clearance Center, Inc)

Рис. 30.9.

Культура чумного микроба к 48 и 72 часу инкубации, выращенная на шоколадном агаре

при 25°С (а, b) при 37°С (c, d)

380

1 Несмотря на то, что впервые данные формы бактерий были обнаружены в 1894 году Николаем Фёдоровичем Гамалеей, буква L указывает на Институт Листера

(Lister Institute of Preventive Medicine), в честь которого германско-британский мик-

робиолог Эмми Клинебергер-Нобель (1892–1985) назвала эти формы, обнаружив их в 1935 году.

381

Рис. 30.12. Культура чумного микроба к 7 неделе инкубации, выращенная в триптиказо-соевом бульоне (а) и выращенная на SBA-агаре (b, правая чашка). Обе среды содержали 150 г/л NaCl. Обратите внимание, насколько больше колонии чумного микроба, выращенные на SBA-агаре (b, левая чашка) без добавления соли

(по Malek M. A., 2017)

Рис. 30.13. Электронная микроскопия клеток чумного микроба (верхний ряд) и клеток чумного микроба, подвергшихся воздействию NaCl (нижний ряд). Красными стрелками отмечены клеточные стенки (по Malek M. A., 2017). Именно такое их расположение обеспечивает биполярное окрашивание, которое мы видели на Рис. 13.8

382

Рис. 30.14. Электронная микроскопия клеток чумного микроба в некультивируемой форме. Стрелками отмечены клетки коккоподобной формы

(по Pawlowski D. R., 2011). Сравните их с L-формой на Рис. 30.13

чивающий» токсичные соединения из бактерии, а также порин OmpF, регулирующий осмотическое давление. Немалую роль в этом процессе играет и натрий-водородный обменник (антипортер Na+/H+), обеспечивающий ионный обмен между клеткой и средой (также является фактором вирулентности).

Помимо L-форм, в ответ на действие неблагоприятных факторов, чумной микроб может переходить в некультивируемые формы (VBNC, от англ. viable but non-culturable), когда бактерия находится в состоянии крайне низкой метаболической активности и не способна к делению. Опасность такого состояния заключается в том, что бактериальная клетка остаётся живой и при благоприятных условиях, например, проведении определённых манипуляций («реанимации»), может перейти обратно в культивируемую форму. Вполне возможно, что длительные межэпизоотические периоды обусловлены переходом чумного микроба в эту форму. Об этом следует помнить, проводя исследования проб окружающей среды (особенно воды).

383

Экспериментально доказано1, что пребывание Y. pestis в холодной водопроводной воде (4°С) способно к 28 дню перевести 106 КОЕ/мл в некультивируемую форму2. Клетки этой формы имеют морфологические изменения: цитоплазма сконденсирована в небольшой округлый цитозоль, а периплазматическое пространство, соответственно, значительно увеличено (Рис. 30.14). Для «реанимации» клетки культивировали в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом, однако количество выросших клеток оказалось невелико.

* * *

Полученные культуры, а также образцы клинического материала (пунктат из бубона, кровь, мокрота, срезы и отпечатки органов) исследуют под микроскопом (микроскопируют) с целью визуального обнаружения микроба. Ранее мы уже видели мазки крови (Рис. 7.6 и 13.8) и пунктата бубона (Рис. 13.6), а сейчас подробнее остановимся на технике их приготовления.

Для приготовления мазков необходимо использовать обезжиренные предметные стёкла. Для этого их вымачивают в хромовой смеси или 10%-ном растворе серной кислоты, после чего кипятят 30 минут в 5%-ном растворе соды, либо 30–40 минут в 1–3%-ном растворе гидроксида натрия с добавлением мыла3, а утром кипятят в течение часа с добавлением мыла. Если используются новые стёкла, этап вымачивания можно пропустить. После кипячения стёкла многократно промывают водой, после чего обрабатывают спиртом

1 Pawlowski D. R., Metzger D. J., et al. Entry of Yersinia pestis into the viable but nonculturable state in a low-temperature tap water microcosm. PLoS One. 2011; 6(3):e17585; DOI: 10.1371/ journal.pone.0017585.

2Целостность клеточной мембраны и метаболическая активность свидетельствуют о том, что клетки не погибли. Первое проверяется путём обработки клеток нуклеазой ДНКазой I в течение суток (при нарушении целостности мембраны нукеаза разрушает геномную ДНК), а второе – путём инкубирования клеток со смесью радиоактивно меченных аминокислот (при сохранении метаболической активности, хотя и медленнее, аминокислоты будут включаться во вновь транслируемые белки, что можно определить по радиоактивной метке).

3Ранее также замачивали на ночь в 5%-ном растворе лизола, но из-за токсичности в ряде стран он вышел из употребления.

384

или смесью Ники форова1 . Однако на практике обезжиривание осуществляют путём тщательного натирания стекла куском мыла с двух сторон и полировки сухой тканью (с этой целью можно использовать полотенце, заткнутое за завязку противочумного халата). После обезжиривания держать стекло можно только за рёбра. Подписывают стекло на матовой поверхности карандашом 2 , поскольку он не сотрётся во время дальнейшей фиксации, и кладут на специальный планшет для предметных стёкол, который ставят на поддон с салфеткой, смоченной раствором дезинфектанта. На практике вместо планшета используют чашку Петри с двумя спичками. Класть стекло без спичек не следует, поскольку взять такое стекло, не прикасаясь к его поверхности, будет крайне сложно. Чашку размещают рядом с горелкой, пламя которой обеспечивает чистоту работы.

С помощью петли на предметное стекло наносят физиологический раствор таким образом, чтобы капли (их количество соответствует количеству мазков) не соприкасались друг с другом. Обычно наносят две капли. Затем обожжённой петлёй рядом с каплей наносят культуру, плавными круговыми движениями растирают её и вносят в каплю, после чего, не обжигая петлю, можно внести её во вторую каплю. Это делается для того, чтобы получить второй, менее густой, мазок. Далее чашку накрывают крышкой, оставляя небольшое отверстие, чтобы мазки могли подсохнуть. Строго запрещается высушивать их над пламенем горелки, а также фиксировать в нём, поскольку в таком случае микроорганизмы не только не погибнут, но и имеется риск их аэрозолирования. Для фиксации мазки с помощью пинцета помещаются в фиксирующую жидкость (96%-ный раствор этилового спирта или реже смесь Никифорова),

асам пинцет обжигается в пламени горелки. Фиксация мазков

1Предложена российским врачом Михаилом Никифоровичем Ники форовым (1858–1915). Способ приготовления: этиловый спирт и простой эфир серной кислоты в равных объёмах.

2Можно использовать карандаш по стеклу, который можно изготовить одним из следующих способов. Способ 1: смешать одну часть свиного сала с шестью частями воска, в которые при нагреве внести до тёмного окрашивания краску судан II (С18Н16N2O) тщательно перемешать и вылить в форму. Способ 2: расплавить семь частей воска с одной частью парафина, добавить три части касторового масла, краску судан III (C22H16N4O) до получения тёмного окрашивания, тщательно всё перемешать, варить и вылить в форму.

385

продолжается 10–15 минут (для толстых мазков – 20 минут), но обычно фиксируют не менее 30 минут, чтобы мазок был полностью обеззаражен. После окончания фиксации мазок вынимают пинцетом и высушивают либо обжигают в пламени горелки, чтобы избавиться от остатков фиксирующей жидкости (если это не запрещено методикой, как в случае метода флуоресцирующих антител, о чём подробнее будет сказано далее).

Для приготовления мазка из мокроты посуду с ней необходимо располагать как можно ближе к предметному стеклу, поскольку данный материал вязкий и может упасть при переносе из посуды, а все манипуляции следует осуществлять над раствором дезинфектанта. Если мокрота густая, то кусочек её вносится в каплю физиологического раствора и растирается в ней.

Мазок с содержимым бубона, как говорилось в предыдущей главе, приготавливают у постели больного. Если он не был фиксирован, то фиксируют по методике, описанной выше.

Фиксированный мазок окрашивают по методу, предложенному

в1884 году Гáнсом Кристиáном Грáмом1 (окраска по Грáму)2:

1)на мазок пинцетом кладут фильтровальную бумагу (она не должна свисать с краёв), на которую обильно наливают генцианвиолет (1 г в 10 мл 96%-ного раствора этилового спирта3);

2)через две минуты краску сливают, удаляют пинцетом фильтровальную бумагу и обильно промывают мазок дистиллированной водой, чтобы удалить с него остатки краски;

3)наносят раствор Люгóля4 на две минуты, снова промывают дистиллированной водой и наливают на полминуты 96%-ный рас-

1 Hans Christian Joachim Gram, 1853–1938; датский врач, бактериолог. Автор работ по красным кровяным тельцам. Разработанная им методика окраски позволила Эмилю Ру в 1886 году разделить бактерии на грамположительные и грамотрицательные.

2Gram H. C. Über die isolierte Färbing der Schizomyceten in Schnittund Trockenpräparaten. Fortschritte der Medizin. 1884; 2:185–189.

3Свежеприготовленный раствор перед использованием необходимо отстоять при комнатной температуре сутки или два часа при температуре 37°С. В норме раствор может иметь осадок, фильтровать его не обязательно.

4Предложен французским врачом Жан-Гийомом Огюстом Люголем (1786–1851)

вкачестве препарата от туберкулёза. Способ приготовления: растворить 2 г йодида

386

твор этилового спирта для обесцвечивания мазка, после чего снова обильно промывают его дистиллированной водой1;

4) наносят фуксин Пфéйффера2 (или сафранин) на одну минуту, после чего мазок снова промывают дистиллированной водой и просушивают.

Грамотрицательные бактерии (Г−) окрашиваются в красный цвет, а грамположительные (Г+) – в фиолетовый. Происходит это из-за того, что у грамположительных бактерий клеточная стенка содержит дополнительный липополисахаридный (эндотоксический) слой, который удерживает генцианвиолет и раствор Люголя, не давая его смыть 3 . У грамотрицательных бактерий, напротив, клеточная стенка тонкая, и генцианвиолет с раствором Люголя легко смываются и обесцвечиваются спиртом.

В условиях мобильных лабораторий целесообразно окрашивать по Граму в модификации А. И. Синёва. Для этого готовят раствор, состоящий из 1 г кристаллвиолета (метилвиолета или генцианвиолета), 5 г глицерина и 100 мл 96%-ного этилового спирта, которым после суточного отстаивания пропитывают полоски фильтровальной бумаги. Эти полоски можно достаточно долго хранить в тём-

калия в 2 мл дистиллированной воды и после растворения добавить 1 г кристаллического йода. Энергично встряхивать до растворения йода и добавить 300 мл дистиллированной воды, после чего профильтровать.

1Начинающим специалистам, по мнению советского (российского) врача Николая Ивановича Розанова, целесообразнее использовать на данном этапе раствор так называемого йодированного спирта (2-4 мл 10%-ного спиртового раствора йода на 100 мл 95%-ного раствора этилового спирта), который наносят на две минуты, после чего обильно промывают дистиллированной водой.

2Предложен немецким врачом Ри хардом Фри дрихом Иога нном Пфе йффером (1858–1945) как модификация способа немецкого врача Фра нца Ци ля (18571926)– . Способ приготовления: к 1 г тщательно растёртого сухого основного фуксина прибавить небольшими порциями (растирается каждая порция) 5 г кристаллической карболовой кислоты или добавить по каплям 5 мл 97%-ной карболовой воды. Продолжая растирание, прибавить по 16–20 капель глицерина, затем 10 мл этилового спирта и довести небольшими порциями дистиллированной воды до 100 мл. Приготовленный раствор фильтруется (он должен иметь на своей поверхности плёнку металлического вида) и разводится дистиллированной водой в соотношении 1:10.

3За исключением Deinococcus-Thermus spp.

387

Фиксированный мазок с «мякотью бубона китайца», сделанный Александром Йерсеном 11 июля 1894 года (через 21 день после открытия возбудителя чумы)

ной таре с притёртой пробкой1. На фиксированный мазок наносят 2-3 капли дистиллированной воды, после чего с помощью пинцета накладывают полоску и слегка придавливают её к стеклу. Через 2 минуты снимают и промывают дистиллированной водой. Далее продолжают окраску по Граму по ранее обозначенной схеме со стадии 3.

В качестве альтернативы используют окраску метиленовым синим («синькой»), предложенную2 Фри дрихом Лёффлером3. Растворяют 3 г метиленового синего в 2 мг 96%-ного раствора этилового спирта. Приливают 1 мл 1%-ного раствора гидроскида калия и 100 мл дистиллированной воды, после чего тщательно перемешивают. Приготовленная краска должна созревать несколько месяцев, поэтому для ускорения созревания её заливают в посуду наполовину, закрывая рыхлой ватной пробкой для лучшей аэрации. Созревший раствор устойчивый и может храниться, закрытый стек-

1 В отсутствие фильтровальной бумаги, по совету советского (российского) врача Натальи Никифоровны Клемпа рской (1914–2003), возможно использовать полоски газетной бумаги, пропитанные 10%-ным спиртовым раствором генцианвиолета. Кроме того, целесообразно приготавливать красящие бумажки для всех растворов: для генцианвиолета (клисталлвиолета, метилвиолета) – к 10 мл этилового спирта добавляют 1 г краски и 0,5 мл глицерина; для раствора Люголя – к 1 г кристаллического йода добавить 2,5 г йодида калия и 10 мл дистиллированной воды; для фуксина – к 0,1 г краски добавить 0,5 мл карболовой кислоты.

2Löffler F. Weitere Untersuchungen über Beizung und Färbung der Geißeln bei den Bakterien.

Centralblatt für Bakteriologie. Mai 1890. Bd. VII.S. 625.

3Friedrich August Johannes Loeffler, 1852–1915; германский (прусский) врач, бак-

териолог, гигиенист. Один из основоположников медицинской микробиологии, открыл возбудитель сапа.

388

лянной или резиновой пробкой, несколько лет. Для окраски на фиксированный мазок наносят раствор таким образом, чтобы он покрыл его полностью, выдерживают пару минут и смывают.

Грамположительные бактерии окрашиваются в голубой цвет, а грамотрицательные – в тёмно-синий.

Легко и быстро определить грамотрицательную культуру можно с помощью теста, предложенного1 в 1978 году Т. Грéгерсеном2, в основе которого лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии гидроксидом калия. Для постановки теста исследуемую культуру суспендируют в 3%-ном растворе гидроксида калия (подобно тому, как готовят мазок). С точки зрения биологической безопасности целесообразнее делать это в чашке. Если в результате суспензия стала вязкой и нити слизи тянутся за петлёй на 1–2 см (т. е. имеет место разрушение клеточной стенки), то исследуемая культура является грамотрицательной. В этом случае, хотя культура и грамотрицательная, тест называют положительным (вот такой парадокс).

Критерии определения случая чумы, установленные Всемирной организацией здравоохранения, предполагают также окрашивание по Вéйсону и Ги мзе, благодаря которым возможно увидеть характерную для клеток чумного микроба биполярность (по типу «английских булавок»). Рассмотрим их.

Окрашивание по Романóвскому – Ги мзе, известное как «рас-

твор Гимзе для окрашивания по Романовскому» (нем. Giemsasche Lösu g für die Roma ows Färbu g)3 было разработано Дмитрием Леонидовичем Романóвским4 и Густавом Ги мзой1. Суть метода за-

1Gregersen T. Rapid method for distinction of gram-negative from gram-positive bacteria. Eur J Appl Microbiol Biotechnol. 1978; 5:123–127.

2T. Gregersen; датский ветеринарный врач.

3Справедливости ради нужно отметить, что метод окрашивания был впервые предложен в 1889 году польским врачом Чеславом Хенцинским и получил известность благодаря работам российского врача Дмитрия Леонидовича Романовского. Позже метод был уровершенствован Джеймсом Гомером Райтом и Густавом Гимзой.

41861–1921; российский врач, терапевт, гематолог, бактериолог. Дал описание строения малярийного плазмодия.

389