Опера о чуме (учебник)

лянт1), для получения сыворотки (постановки иммуносерологических реакций).

Кусочки органов от трупов (аутопсийный материал). Обеззараживают металлические части инструментов (скальпелей, ножниц) – смачивают 95%-ным раствором спирта и поджигают, после чего следует немного подождать, чтобы металл остыл. Далее аккуратно отделяют небольшие фрагменты и помещают их в контейнеры с транспортной средой. Для взятия крови из сердца животного последнее фиксируется браншами пинцета. Раскалённым скальпелем прижигают переднюю стенку его до появления белого пятна, после чего проникают в полость сердца иголкой шприца и отбирают кровь. Мочу, желчь и иные биологические жидкости берут аналогич-

ным образом. С другой стороны, если животное давно пало (т. е. умерло), и кровь нужна только для посева, то ножницами отрезают его верхушку и делают отпечаток на поверхности агара. Для взятия костного мозга пинцетом и ножницами освобождают от мышц и сухожилий среднюю часть бедренной кости. Под освобождённый участок подкладывают небольшую стерильную салфетку, смоченную раствором дезинфектанта, и перекусывают кость ножницами, прикрывая крышкой от чашки во избежание разбрызгивания материала. У крупных животных кость перерезают пилкой. Отрезок кости с помощью пинцета поднимают вверх и из костно-мозгового канала петлёй забирают материал для посева.

Для исследования на наличие антител и антигенов (Глава 33) пригодны и высушенные образцы крови и сыворотки, приготовленные путём пропитывания фильтровальной бумаги, предварительно обработанной 0,1%-ным раствором мертиолята натрия. Высушенные образцы хранятся в пробирках в течение 3 недель при комнатной температуре или до 3 месяцев при 4°С. Перед исследованием в пробирку с бумажкой добавляют 1 мл забуференного физиологического раствора и выдерживают 40 минут (полученный раствор примерно соответствует разведению сыворотки 1:10).

В случае грызунов вскрывают их грудную клетку, сохраняя диафрагму, но удаляя лёгкие. Далее рассекают крупные сосуды и серд-

1 Как правило, используют 4%-ный раствор цитрата натрия в отношении 1:10 к объёму крови или 6%-ный раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в отношении 1:20 к объёму крови.

360

це, после чего в полость вводят пропитанную мертиолятом бумажку, в которую впитается примерно 0,2 мл крови.

Похожим образом берут смывы из грудной полости, для чего после рассечения крупных сосудов и сердца вливают в грудную полость 0,5–1 мл физиологического раствора с мертиолятом натрия в разведении 1:4000. Аккуратно перемешивают и переносят в пробирку. в которую добавляют тот же раствор, но в разведении 1:8000.

В палате с больными лёгочной формой чумы берут пробы воздуха и смывы с поверхностей.

Все ёмкости с материалом маркируются и обрабатываются снаружи раствором дезинфектанта. Далее они упаковываются по принципу тройной упаковки, который подразумевает наличие трёх защитных слоёв:

1 слой – первичная ёмкость. Водонепроницаемая и герметичная, именно в ней хранится образец (материал);

2 слой – вторичная тара. Также водонепроницаемая и герметичная, содержит достаточно абсорбирующего материала в случае повреждения (протечки) первичной ёмкости. В одну вторичную тару допустимо помещать несколько первичных ёмкостей (например, несколько проб от одного пациента). Сюда же кладут одно из направлений (второе передаётся с лицом, осуществляющим доставку пробы);

3 слой – наружная тара, в которую помещают вторичную тару с достаточным количеством амортизирующего материала, обеспечивающего его сохранность. Минимальные размеры этой тары не могут быть меньше, чем 10 х 10см.

Упакованный материал транспортируется в лабораторию в холодильнике при температуре не выше минус 16°С, а если это невозможно, то он должен быть доставлен в течение 5–6 часов после взятия материала!

При проведении эпизоотологического обследования природных очагов чумы проводят лабораторное обследование зоологоэнтомологического материала и проб окружающей среды. Обследованию подлежат носители (грызуны, зайцеобразные и реже мел-

361

Рис. 29.1. Длиннохвостая ласка

(Neogale frenata),

отловленная в металлическую клетку в очаге (1975)

кие хищники) и переносчики (блохи и иные эктопаразиты), отловленные на территории очага. Живых животных транспортируют в металлических клетках или ящиках с сетчатыми крышками (Рис. 29.1). Если экспериментальных исследований живых носителей не предполагается, то их умерщвляют в капкане корнцангом или иным гуманным способом. Во избежание потерь эктопаразитов тушки животных (в том числе обнаруженные мёртвыми) транспортируют в бязевых мешках (очёс осуществляют на территории временной лабораторной базы в очаге или в боксе для работы с

Рис. 29.2. Очёс суслика, отловленного в очаге, в условиях временной (полевой) лаборатории. Суслик находится под действием эфира.

Внимательный читатель, вероятно, испытывает негодование из-за отсутствия средств индивидуальной защиты,

но так работали ещё в конце прошлого века. Обратите внимание, что очёс осу-

ществляют над эмалированной посудой, из которой блохи не могут выпрыгнуть

362

Рис. 29.3. Очёс крыс, отловленных в одном из поселений провинции Тайнинь (Вьетнам). Обратите внимание на «уличные» условия работы – так работали чумологи в странах Юго-Восточной Азии ещё 20 лет назад (сейчас ситуация изменилась в лучшую сторону, а чумной микроб не выделяется во Вьетнаме с 2005 года). Справедливости ради отметим, что при аккуратной работе риск аэрогенного заражения во время очёса невелик, а чума, вызванная антибиотикочувствительными штаммами, легко поддаётся лечению. Фотография любезно предоставлена Виктором Васильевичем Сунцовым (слева).

инфицированными животными; Рис. 29.2 и 29.3). Во время активных эпизоотий иногда обследуют диких грызунов (как живых, так и мёртвых) на фарингеальное бактерионосительство, для чего зондом берут материал с глотки (мазок). Эктопаразитов, собранных в очаге, доставляют в пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками, живыми или в консервирующем растворе1. Также собирают погадки птиц, остатки пищи из гнёзд, почву нор грызунов и воду, транс-

1 Раствор хлорида натрия с генцианвиолетом в соотношении 1:200000–1:300000.

363

▲Рис. 29.4. Патологоанатомическое исследование луговой собачки (Cynomys sp.), являющейся членом колонии, вымершей в Чаббс-парке

(штат Колорадо, США) во время эпизоотии чумы (1959)

▼ Рис. 29.5. Патологоанатомическое исследование сурков в условиях полевой лаборатории в Алайском высокогорном природном очаге (Киргизия)

364

портировка которых осуществляется по принципу тройной упаковки.

В случае необходимости фрагменты органов животных извлекаются во временной лаборатории в очаге (порядок патологоанатомического вскрытия животных будет рассмотрен далее). Исследуются печень и селезёнка, а при выявлении характерных для чумы патологоанатомических изменений внутренних органов дополнительно исследуют лёгкие и лимфатические узлы (Рис. 29.4 и 29.5). От животных, обнаруженных мёртвыми, также исследуют кровь из сердца и околосердечного пучка сосудов, а также костный мозг (из бедренной кости) и крайне редко головной мозг. Транспортировка проб осуществляется по принципу тройной упаковки. В случае длительной транспортировки используют консервирующие жидкости (например, жидкость Брокэ).

Чумной микроб является факультативным анаэробом1 и относится к природным ауксотрофам2, поскольку помимо источника энергии нуждается в аминокислотах, что является следствием его редкого обитания вне носителя. Большинство штаммов основного подви-

1Растут и развиваются как в присутствии, так и в отсутствии кислорода за счёт способности переключать свой энергетический метаболизм с аэробного дыхания на брожение или анаэробное дыхание.

2Не способны синтезировать органические соединения, необходимые для роста, что отличает их от Y. pseudotuberculosis, которая относится к прототрофам. Имеются сведения, что в популяциях чумного микроба иногда встречаются полностью прототрофные клоны (равно как и в популяциях Y. pseudotuberculosis, хотя и крайне редко, встречаются ауксотрофы). Однако потребности отличаются. Так, например, при повышенной температуре штаммы Y. pestis обязательно проявляют зависимость от изолейцина, тогда как штаммы Y. pseudotuberculosis нет. Вместе с тем феномен прототрофности штаммов Y. pestis подвергается сомнению рядом специалистов, считающих его следствием ошибочной идентификации псевдотуберкулёзных штаммов в качестве чумных.

365

да нуждается в метионине, фенилаланине и аргинине, а также других аминокислотах, характерных для штаммов различных очагов (Табл. 30.1). Потребность в аминокислотах у штаммов неосновного подвида также индивидуальна (Табл. 30.2).

Причиной этого являются мутации в генах. Так, например, зависимость от метионина обусловлена мутацией в гене metB. У штаммов основного подвида в позиции 988 гена имеется делеция единичного нуклеотида (−G), а у гиссарских штаммов в позиции 989 – инсерция (+G). У кавказских штаммов мутации в генах argA, apoG, apoF, thiH и thiG обуславливают потребность в аргинине, фенилаланине, тирозине и тиамине. По этой причине для работ с культурой чумного микроба используют жидкие и твёрдые питательные среды, в которые добавляют различные аминокислоты 1 , однако на практике чаще используют среды, изначально богатые различными питательными веществами.

В качестве стимуляторов роста также иногда добавляют сульфит натрия в количестве 1 мл 2,5%-ного раствора на 100 мл среды, гемолизированную кровь в концентрации 0,05–1,00%.

Стандартной средой согласно рекомендации Всемирной организации здравоохранения2 является кровяной агар, приготовленный из овечьей крови (SBA, от англ. sheep blood agar). В качестве альтернативы могут использоваться агар с сердечно-мозговым экстрактом (BHI, от англ. brain heart infusion), питательный агар (nutrient agar) и триптиказо-соевый агар (trypticase soy agar), но чумной микроб на них растёт медленнее. Используют также агары МакКóнки ( ac o e agar), Хоттингера (Hottinger agar) и Мартéна (Martin agar) с сульфитом натрия и генцианвиолетом, либо агары на гидролизатах казеина, рыбной муки и кильки каспийской, мясопептонной воде. Если достоверно известно, что материал не загрязнён посторонней микрофлорой, то допускается генцианвиолет не добавлять. При работе в полевых используют дезоксихолатный агар, поскольку при этом не требуется стерилизация и чумной микроб может быть выделен даже при комнатной температуре.

1Например, в случае кавказских штаммов тиамин (витамин В1) добавляют в количестве 0,0001 мг на 100 мл среды.

2Dennis D. T., Gage K. L., et al. Plague manual: epidemiology, distribution, surveillance and control, World Health Organization, WHO/CDS/CSR/EDC/99.2, 1999, 172 p.

366

Табл. 30.1. Потребность штаммов основного подвида из различных

Табл. 30.2. Потребность штаммов неосновного подвида в аминокислотах

Примечание:

* – только для штаммов из очагов на территории Армении.

± – часть штаммов ауксотрофны (данные противоречивы). ? – данные отсутствуют.

Первые попытки создания селективной среды, то есть специально разработанной для выделения конкретной бактерии путём подавления роста остальных, относятся к 1917 году, когда Дженни Дрéннан1 и Оскар Тиг2 предложили3 добавлять в среду кристаллический фиолетовый. В настоящее время в качестве селективной среды для йерсиний используют CIN-агар (от англ. Cefsulodin-Irgasan- Novobiocin agar), однако опыты 4 показывают, что из-за сильных ингибирующих свойств через 36 часов инкубации (т. е. выращивания) при термпературе 28°С вырастает только 5% бактерий. Используют также гектоеновый агар (HEK, от англ. hektoen enteric

1Jennie G. Drennan; американский врач, бактериолог.

2Oscar Teague; американский врач, бактериолог, иммунолог.

3Drennan J. G., Teague O. A selective medium for the Isolation of B. Pestis from contaminated Plague Lesions and observations on the growth of B. Pestis on Autoclaved Nutrient Agar. J Med Res.

1917; 36(3):519–532.

4 Russel P., Nelson M., et al. Laboratory diagnosis of plague. Br J Bio Sci. 1997; 5(54): 231–236.

368

agar) и BIN-агар, разработанный 1 на основе сердечно-мозгового агара.

Для подавления роста посторонней микрофлоры чаще добавляют генцианвиолет в концентрации 1:100000–1:800000, но могут быть использованы теллурит калия в концентрации 1:300000, дезоксихлорат натрия в концентрации 10 мг/л и фосфомицин в концентрации 50–100 мкг/мл.

Для дифференциации чумного микроба (т. е. в данном случае – отличия от других) используют дифференциальные среды, при росте на которых разные бактерии окрашиваются в различные цвета. Это удобно, поскольку бактерии различных видов могут образовывать похожие колонии, и при изучении отдельных изолированных колоний на обычных питательных средах есть вероятность принять две одинаковые на вид колонии за относящиеся к одному виду микроорганизмов. В основе принципа работы дифференциальных сред лежит способность микроорганизма ферментировать различные субстраты, о чём подробнее поговорим в следующей главе. Примером такой среды может служить цветная дифференциальная среда, позволяющая отличать колонии чумного микроба от псевдотуберкулёзного по способности последнего разлагать мочевину. Так, в случае Y. pestis среда приобретает зеленоватый отте-

нок, а в случае Y. pseudotuberculosis – синий.

Отдельного внимания заслуживают так называемые хромогенные питательные среды, состав которых приводит к окрашиванию колоний. Первая такая среда была предложена2 в 1988 году Лóуренсом Рестáйно (с коллегами), а чумная среда основанной им фирмы R & F Products содержит хромогенный субстрат Х-β-D- глюкопиранозид, реагирующий с β-глюкозидазой чумного микроба с образованием осадка, окрашивающего колонии за счёт индикатора рН в синий цвет (Рис. 30.1). Кроме того, среда содержит сахарозу, L-рамнозу, целлобиозу и лактозу, которые Y. pestis не фер-

1 Ber R., Mamroud E., et al. Development of an improved selective agar medium for isolation of Yersinia pestis. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(10):5787–5792; DOI: 10.1128/ AEM.69.10.5787-5792.2003.

2 Frampton E.W., Restaino L., et al. Evaluation of the β-Glucuronidase Substrate 5-Bromo-4- Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronide (X-GLUC) in a 24-Hour Direct Plating Method for Escherichia coli. J Food Prot. 1988; 51(5):402–404; DOI: 10.4315/0362-028X-51.5.402.

369