Опера о чуме (учебник)

как митоген-активируемой протеинкиназы, так и транскрипционного фактора-κB (читают как «каппа-би»), ингибируя, таким образом, продукцию провоспалительных цитокинов. Интересно, что YopH, который катализирует дефосфорилирование специфических белков-макрофагов, что приводит в том числе к снижению продукции интерлейкинов (и, как следствие, снижению функции иммунной системы), при этом, вероятно, имеет эукариотическое происхождение.

В какой-то степени эффекторные Yop-белки можно рассматривать в качестве бактериального эквивалента вирусных онкобелков, поскольку они имитируют или улавливают клеточные сигналы, причём более эффективно, чем их эукариотические аналоги, вызывая нарушение регуляции нормального клеточного функционирования путём чрезмерной активации или ингибирования сигнального пути, что приводит к обозначенным последствиям. Вместе с тем, в отличие от вирусных онкобелков, Yop-белки остаются в бактериальной клетке в состоянии покоя, становясь «активными» только в клетках-мишенях (в ответ на изменение температуры и содержания кальция).

Рис. 6.2. Схема (не масштабная) проникновения LcrV и Yop-белков в цитоплазму клетки млекопитающего с помощью VCAT и системы секреции III типа

90

Важно подчеркнуть, что в условиях кислой среды (рН ≤ 6), значительно снижается экспрессия YopE, YopN и YopD, поэтому рН6антиген, о котором речь шла ранее, выступает в роли независимого фактора устойчивости Y. pestis к фагоцитозу.

Плазмида pFra (pYT и pMT1)

Данную плазмиду чумной микроб, вероятно, приобрёл у Salmonella enterica subsp. enterica ser1. typhy в результате горизонтального переноса, поскольку она на 97% идентична плазмиде pHMC2 этого вида. Плазмида pFra содержит caf-оперон, который кодирует синтез капсульного антигена или фракции I (Fra2, F1 и FI, от англ.

1952 году4 (метод Э. Бéйкера5 ). Капсульный антиген представляет собой многофункциональный белок существующий в трёх изоморфах:

Caf1NT1 (основной),

Caf1NT2 (штаммы Центрально-Кавказского высокогорного очага),

Caf1NT3 (штаммы Восточно-Кавказского высокогорного очага6).

Капсульный антиген синтезируется при 37°С (при 28°С его синтезируется в 1000 раз меньше!) и образует большую гелеобразную полимерную оболочку (капсулу), покрывающую всю внешнюю по-

1Так обозначают серовариант, то есть группу микроорганизмов одного вида, объединённых общей антигенной структурой, определяемой серологическими методами.

2Отсюда основное название плазмиды («р» – plasmid + «Fra» – fraction).

3Edgar E. Baker американский врач, бактериолог.

4Baker E. E., Sommer H., et al. Studies on Immunization Against Plague: I. The Isolation and Characterization of the Soluble Antigen of Pasteurella Pestis. J Immunol. 1952; 68(2):131–145;

DOI: 10.4049/jimmunol.68.2.131.

5Выращенную в течение трёх суток на плотной питательной среде при 37°С культуру чумного микроба смывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия и двукратно обезвоживают охлаждённым ацетоном. Затем фракцию I экстрагируют 2,5%- ным раствором хлорида натрия при комнатной температуре сутки, после чего выделяют из раствора соли насыщенным раствором сульфата аммония (рН 7,5).

6Отличительной особенностью этих штаммов, именуемых кавказскими, является бо льший размер плазмидыpFra за счёт наличия двух дополнительных областей.

91

на лимфоидных клетках, препятствуя развитию адекватного иммунного ответа. Важно понимать, что в отличие от системы секреции III типа механизм устойчивости к фагоцитозу обеспечивается не введением белков в фагоцит с последующим цитотоксическим действием, а блокированием возможности поглощения бактерии фагоцитом. Реализация данного механизма достаточно затянута во времени (до 5 часов), однако она снижает вероятность фагоцитоза с

1Иногда его ещё называют фракция II.

2Ajl S. J., Reedal J. S., et al. Studies on plague. I. Purification and properties of the toxin of Pasteurella pestis. J Bacteriol. 1955; 70(2):158–169; DOI: 10.1128/jb.70.2.158-169.1955.

92

Y. pestis в кишечнике блохи, чтобы далее при участии pgm-области сформировать чумной блок.

Плазмида pPla (pYP, pPst и pPCP1)

Данная плазмида, по-видимому, приобретена чумным микробом в результате горизонтального переноса генов у того же вида сальмонелл, только другого серовара – Salmonella enterica subsp. enterica ser. typhimurium. Она содержит гены pla, pst и pim, которые кодируют синтез активатора плазминогена, бактериоцина (пестицина) и белка иммунитета к пестицину соответственно.

Активатор плазминогена (Pla1, от англ. plasminogen activatior)

является поверхностной протеазой (т. е. ферментом, расщепляющим пептидную связь между аминокислотами в белках), и поскольку он обладает высокой гомологией с четырьмя поверхностными протеазами других энтеробактерий (PgtE – Salmonella enterica,

SopA – Shigella flexneri, OmpT и OmpP – Escherichia coli), то все они объединены в одно семейство омптиновых протеаз (от англ. omptin, OmpT; внимание: не путать с порином OmpY!), которые расщепляют пептидную связь с помощью молекулы воды. Интересно, что при различной температуре активатор плазминогена способен проявлять как фибринолитическую активность (37°С), так и плазмокоагулазную (27°С). Первое было показано Р. Р. Мэдисоном 2 в 1936 году 3 , второе – Эрнéстом Джáвецем 4 и Карлом Фридрихом Мáйером5 в 1944 году6, однако взаимосвязь между этими свойствами доказал уже не раз упомянутый Игорь Валерьянович Домарад-

1Отсюда основное название плазмиды («р» – plasmid + «Pla» – plasminogen activator).

2R. R. Madison американский врач, бактериолог.

3Madison R. R. Fibrinolytic specificity of B. pestis. Proceeding of the Society for the Experimental Biology and Medicine. 1936; 34(3):301–302; DOI: 10.3181/00379727-34-8597G.

4Ernest Jawetz, 1916–?; австрийский и американский врач польского происхождения, бактериолог. Эмигрировал в США в 1939 году, спасаясь от нацистов.

5Karl Friedrich Meyer, 1884–1974 швейцарский и американский ветеринарный врач, бактериолог, патолог. Крупный исследователь многих инфекционных болез-

ней, названный «Пастером XX века».

6 Jawetz E., Meyer K. F. Studies on plague immunity in experimental animals. II. Some factors of the immunity mechanism in bubonic plague. J Immun. 1944; 49(1):15–30.

93

ский (с коллегами) лишь в 1963 году1. Активатор плазминогена играет важную роль на начальных этапах патогенетического процесса при бубонной форме чумы. Благодаря плазмокоагулазной активности он расщепляет и инактивирует ингибитор пути тканевого фактора (TFPI, от англ. tissue factor pathway inhibitor), обеспечивая свёртывание крови в месте проникновения в млекопитающего. Затем благодаря фибринолитической активности, возникающей под действием температуры тела, обеспечивает активацию плазминогена (отсюда и его название), который в активной форме (плазмин) вызывает разрушение сгустков фибрина, позволяя в месте укуса сформировать обширный бактериальный очаг с небольшим количеством воспалительных клеток, не мешающих диссеминации возбудителя в лимфатические узлы. В обратной же ситуации, когда активатор плазминогена не синтезируется, множество воспалительных клеток быстро блокируют клетки возбудителя, значительно ограничивая их распространение, что и бывает у штаммов, лишённых плазмиды pPla (вспомним: кавказские штаммы). Он участвует в резистентности к системе комплемента (т. е. каскаду ферментов, облегчающих борьбу с инфекционным агентом) путём разрушения С3-компонента, а также проявляет протеолитическую активность (т. е. способность расщеплять белки). В случае первичной лёгочной формы чумы активатор плазминогена не требуется для диссеминации, однако обеспечивает резкое и быстрое размножение, приводя к развитию молниеносной пневмонии и отёку лёгких, то есть фульминантной лёгочной форме, о которой мы уже упоминали в Главе 3. Роль активатора плазминогена в развитии первичной септической формы (когда микроб извне попадает непосредственно в кровяное русло) не отмечена.

Важно отметить, что активатор плазминогена проявляет активность, только связываясь с эндотоксином липополисахаридом (ЛПС), открытым в 1956 году2. Липополисахарид, синтез которого кодируют хромосомные гены, присущ всем грамотрицательным бактериям и, будучи «заякоренным» в бактериальной мембране, обеспечивает структурную целостность бактерии, защищая её

1 Домарадский И. В., Яромюк Г. А., и др. О коагуляции плазмы чумным и псевдотубер-

кулёзным микробами. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1963;

7:79–82.

2 Davies D. A. L. A specific polysaccharide of Pasteurella pestis. J Biochem. 1956; 63:105–116.

94

мембрану от воздействий химических агентов, например, антибиотиков. Состоит из липида А, «заякоренного» дисахарида, и полисахаридных цепей О-антигена (О-боковых цепей), которые соединены друг с другом олигосахаридной цепью, то есть так называемым

олигосахаридом или ко ром1 (S-форма ЛПС). Липид А ответственен за высокую токсичность, поскольку, будучи высвобожденным в кровоток, он способен вызвать системную иммунную реакцию, сопровождающуюся лихорадкой вплоть до септического шока. В составе ЛПС он экранируется остальными структурами, подобно тому, как рождественская ёлка экранирует своими пышными ветвями положенные под неё подарки от зорких детских глаз. ЛПС чумного микроба отличается отсутствием О-антигена (R-форма ЛПС) ввиду приобретённых пяти мутаций в генах, синтезирующих ЛПС, однако именно это позволяет коровой части связаться с активатором плазминогена и влиять на стереометрию (пространственное строение) его молекулы.

Структура ЛПС температурно-зависима и варьируется при 37°С (млекопитающее), 27°С (окружающая среда / блоха) и 6°С (зимовка млекопитающего).

Кор является достаточно консервативным. Он состоит из трёх остатков L-глицеро-α-D-манно-гептозы (LD-Hep) и двух остатков 3- деокси- -D-манно-окт-2-улозоновой кислоты (Kdo) 2 . Внутренняя его область функционирует как рецептор большинства литических бактериофагов, например, ϕА1122. При изменении температуры происходят стереометрические изменения в наиболее близкой к

1От англ. core – «ядро».

2Интересно, что кор ЛПС кавказских, алтайских и гиссарских штаммов отличается от кора ЛПС штаммов основного подвида и улегейских штаммов отсутствием остатка D-глицеро-D-манно-гептозы (DD-Hep) в наиболее удалённом от липида А остатке гептозы (LD-HepIII).

95

липиду А части: замена бокового остатка 3-деокси- -D-манно-окт-2- улозоновой кислоты (Kdo) на остаток D-глицеро- -D-тало-окт-2- узолоновой кислоты (Ko). При 37°С – (Kdo), при 27°С – (Kdo) + (Ko), при 6°С – (Ko). Однако эти изменения не влияют на фибринолитическую и плазмокоагулазную активности1, тем более что у некоторых подвидов (например, кавказские штаммы) замены вообще не происходит. С другой стороны, утрата наиболее удалённой от липида А части кора (её укорочение) приводит к полной потере фибринолитической и плазмокоагулазной активности.

Липид А, напротив, не консервативен (Рис. 6.5). При температуре 27°С он чаще всего является 6-ацильным (т. е. содержит шесть остатков жирных кислот2), а при 6°С и 37°С – 4-ацильным3, который не распознается Toll-подобными рецепторами (TLR, от англ. Toll- like receptor)4 иммунной системы, в частности TLR-4, но об этом позже. Сейчас важно понимать, что наличие 4-ацильного ЛПС при 6°С является одним из механизмов выживания (уклонения от иммунной системы) чумного микроба в теле носителя во время зимней спячки, когда его тело охлаждается примерно до такой температуры. Также нужно отметить, что при одинаковом синтезе активатора плазминогена его активность при 37°С выше, следовательно, 4-ацильный липид А в составе ЛПС оказывает лучшее воздействие на стереометрию активатора плазминогена чумного микроба. Эта мысль подтверждается рядом авторов, которые указывают 5 , что зависимость фибринолитической и плазмокоагулазной «активности» активатора плазминогена от температуры лишь косвенная,

1Изменения влияют на специфичность связывания диагностических (литических) бактериофагов, что будет подробно рассмотрено в Главе 32.

2Четыре остатка 3-гидроксимиристиновой кислоты, один остаток лауриновой кислоты и один остаток пальмитолеиновой кислоты. При данной температуре возможен также синтез 3-ацильных, 4-ацильных, 5-ацильных форм.

3Четыре остатка 3-гидроксимиристиновой кислоты. При данной температуре иногда встречается синтез 3-ацильных и 6-ацильных форм.

4От нем. «классный» названы так по одноимённому гену мушек-дрозофил, который, в свою очередь, назван по реплике «Das war ja toll!» (с нем. «Вот это класс!») немецкого биолога Кристианы Нюсляйн-Фольхард, сказанной в момент обнаружения личинок-мутантов дрозофил с недоразвитой вентральной частью тела. Первый рецептор млекопитающих, TLR-4, был открыт в 1997 году советским (узбекским) и американским иммунологом Русланом Максутовичем Метжитовым (р. 1966) с колл.

5Korhonen T. K., Haiko J., et al. Fibrinolytic and coagulative activities of Yersinia pestis.

Front CellInfect Microbiol. 2013; 3:35; DOI: 10.3389/fcimb.2013.00035.

96

Рис. 6.5. Структуры липида А при различных температурах (по Книрель Ю. А., 2012)

поскольку в сущности «активность» активатора плазминогена зависит исключительно от структуры ЛПС (которая, в свою очередь, уже зависит от температуры). И в этой связи стоит также заметить, что ЛПС Y. pseudotuberculosis, содержащий О-антиген, вообще не «активирует» активатор плазминогена, поскольку боковые цепи О- антигена создают стереометрические препятствия (экранируют активатор плазминогена).

В 1966 году, подвергнув чумной микроб экстракции трихлоруксусной кислотой при 4°С (метод Андрé Буавéна1), А. А. Попов и Владимир Владимирович Аки мович2 выделили3 вещество, иденти-

фицированное как основной соматический антиген (ОСА) или О-антиген. Вместе с тем ранее мы говорили, что в результате эво-

1André Boivin, 1895–1949; французский врач, бактериолог. Работая в Институте бактериологии и иммунологии человека (ныне – Institutul Național de CercetareDezvoltare Medico-Militară „Cantacuzino”), совместно с Лидией и Ионом Месробяну сделал биохимичсекую характеристику эндотоксинов с использованием метода экстракции трихлоруксусной кислотой.

21912–1968 советский врач.

3Попов А. А., Акимович В. В. Производство бакпрепаратов для профилактики и диагностики особо опасных инфекций. Саратов, 1966, С. 140–143.

97

люции Y. pestis потеряла его. Дело в том, что инактивация генов, кодирующих синтез О-антигена, была доказана почти полвека спустя. Полученный в 1966 году антиген действительно не был похож на типичный О-антиген грамотрицательных бактерий по химической структуре и оказался совершенно не токсичным для белых мышей и морских свинок. Более тщательный анализ показал, что ОСА является циклическим тетрамером из повторяющихся трисахаридных единиц, состоящих из ацелированной маннозаминуроновой кислоты, дезоксигалактозы и глюкозы, то есть по хими-

ческому составу это энтеробактериальный общий антиген

(ЭОА), характерный для большинства энтеробактерий. Синтез ЭОА, который многие учёные до сих пор называют ОСА, осуществляется хромосомными генами и тесно связан с синтезом ЛПС. По сути, его можно рассматривать как «дефектный» О-антиген, который не токсичен, но является активным индуктором антител.

Пестицин (Р1, Psn) является бактериоцином, то есть веществом белковой природы, угнетающим рост чувствительных к нему бактерий того же рода или вида. В данном случае пестицин вызывает лизис клеточной стенки некоторых штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis I серовара, содержащих 3,6-дидеоксид-В- рибогексозы (выступают в качестве рецептора для Р1), за счёт гидролиза связи между N-ацетилглюкозамином и N- ацетилмурамовой кислотой в составе муреина (липопротеина клеточной стенки). Для защиты от пестицина бактерия синтезирует

белок иммунитета к пестицину, гены которого расположены на плазмиде pPla, поэтому синтез пестицина направлен на бактерии, не имеющие белок иммунитета – на штаммы, лишенные или имеющие дефект плазмиды pPla, и штаммы Y. pseudotuberculosis I серовара.

Новые плазмиды

Ранее мы говорили, что в природе встречаются штаммы, лишённые pPla или pFra, но способные проявлять высокую вирулентность. Сложно сказать, какие факторы это обеспечивают, однако имеются данные, что чумной микроб может содержать конъюга-

98

тивные (трансмиссивные) плазмиды1. Сообщения об этом появились ещё в 80-х годах прошлого столетия2, однако их функции ещё полностью не изучены. Так, штамм Y. pestis Java-9 (bv. orientalis), выделенный на о. Ява в Индонезии в 1957 году от мёртвой яванской крысы (Rattus rattus diardi), лишён плазмиды pFra, но имеет новые плазмиды pJARS35 (35,044 Кб) и pJARS36 (36,085 Кб). Важной особенностью штамма являются устойчивость к мышьяку и арсениту, за которые, согласно геномному анализу 3 , отвечает транспозон 4 Tn2503, который обнаруживающийся не только на новых плазмидах pJARS35 и pJARS36, но и на плазмидах pCD1 и pPla. Важно отметить, что новые плазмиды также несут гены, отвечающие за реализацию системы секреции IV типа, которая может осуществлять перенос в эукариотическую или прокариотическую клетку белков и ДНК, то есть, в нашем случае, осуществлять конъюгативный перенос плазмид!5 Обнаруженные общие плазмидные локусы с Aeromonas culicicola позволяют предположить, что штамм приобрёл плазмиды от неродственной бактерии. И это важно, поскольку долгое время считалось, что осуществить перенос генов в чумной микроб возможно только в условиях лаборатории. Кроме того, это подтверждает важную мысль, что кишечник кровососущих насекомых (в частности, блохи) может выступать в качестве потенциального места генетического обмена. Можно сказать, что приобретение мышиного токсина Y. pestis способствовало не только расширению круга млекопитающих (что повысило трансмиссивность), как мы говорили ранее, но и стало отправной точкой эволюционного пути для приобретения новых генов (в том числе генов антибиотикорезистентности).

1Следует отметить, что плазмида pFra кавказских штаммов содержит неполноценный tra-оперон, который ранее мог функционировать по своему назначению, то есть обеспечивать процесс конъюгации (переноса генетической информации).

2Tsukano H., Wake A., et al. Plasmid-like properties of the four virulence-associated factors of Yersinia pestis. Microbiol Immunol. 1986; 30(9):837–848; DOI: 10.1111/j.1348-

0421.1986.tb03011.x.

3 Eppinger M., Radnedge L., et al. Novel plasmids and resistance phenotypes in Yersinia pestis: unique plasmid inventory of strain Java 9 mediates high levels of arsenic resistance. PLoS ONE. 2012; 7(3):e32911; DOI: 10.1371/journal.pone.0032911.

4Т. е. участок ДНК, способный к транспозиции (передвижению) внутри генома.

5Проведённые опыты показали возможность передачи плазмид штаммам

Y. enterocolitica.

99