Опера о чуме (учебник)

Рис. 35.4. Чашка с зонами ингибирования. Обратите внимание, что вокруг некоторых дисков с антибиотиками зона ингибирования меньше или вовсе отсутствует, что свидетельствует о частичной или полной резистентности исследуемой культуры к некоторым антибиотикам

гибиции, поскольку в этой ситуации имеется риск отнесения резистентного штамма к чувствительному.

Из всех существующих на сегодняшний день методов определения чувствительности бактерий к

антибиотикам в случае возбудителей особо опасных бактериальных инфекций, помимо диско-диффузионного метода, применяют только метод серийных разведений (МСР), позволяющий определить

минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата за счёт внесения его известного количества в питательную среду.

Важным этапом для данного метода является приготовление основного раствора антибиотика, пригодного для хранения, и рабоче-

470

го, который сразу будет использован для приготовления питательных сред. При этом допустимо использовать как жидкие, так и твёрдые питательные среды, но на практике применяют только твёрдые.

Для основного раствора используют субстанции с известной активностью (в экстренной ситуации допустимо использовать препараты, предназначенные для инъекций), которые взвешивают на аналитических весах с точностью до четвёртого знака и вносят в растворитель. Расчёт массы препарата (навески) осуществляют по формуле:

рмг ,

где С – необходимая концентрация препарата, мкг/мл; V – объём растворителя, мл; КА – активность препарата (количество активного вещества, содержащееся в используемой субстанции), мкг/мл.

На практике взвесить точное расчетное количество вещества невозможно, поэтому, по традиции аналитической химии, готовят навеску, близкую к расчётной, и пересчитывают необходимый объём растворителя по формуле:

где mп – практическая масса препарата (навески), мг; mр – расчётная масса препарата (навески), мг; Vт – объём растворителя, взятый для растворения расчётной навески, мл.

Следует отметить, что для ряда антибиотиков растворителем будут являться два вещества: солюбилизатор и разбавитель (Табл. 35.4). В таком случае препарат растворяют в минимальном объёме солюбилизатора и разводят до необходимого объёма разбавителем.

471

Табл. 35.4. Расворители для антибиотических препаратов

Для приготовления рабочих растворов, из основного путём титрования получают нужные концентрации, используя в качестве растворителя дистиллированную воду. Вместе с тем если используются препараты в фасованном виде (ампулы, флаконы, таблетки), то приготовить рабочие растворы можно следующим образом.

В случае жидкой формы препарат растворяют в известном объёме дистиллированной воды. Например, если имеется флакон, содержащий 5 г вещества, то растворением его в 5 мг дистиллированной

1 Данный препарат не применяется для лечения чумы, однако штаммы чумного микроба проверяются на чувствительность к нему, поскольку устойчивость культуры к налидиксовой кислоте может сопровождаться снижением эффективности лечения фторхинолонами при сохранении к ним чувствительности на чашке.

472

воды получим раствор концентрацией 100000 мкг/мл. Далее, путём титрования можно получить растворы концентрацией 10000 мкг/кг, 1000 мкг/кг и так далее. В случае растворения в солюбилизаторе и разбавителе объём разделяют. Так, например, если имеется капсула налидиксовой кислоты, то её содержимое (500 мг) вносят в 25 мл дистиллированной воды. Затем по каплям добавляют раствор гидроксида натрия (0,1 моль/л) до полного растворения препарата и приливают 25 мл дистиллированной воды, получая таким образом раствор концентрацией 10000 мкг/мл.

В случае твёрдой формы препарат размельчают до порошкообразного состояния и растворяют в известном объёме дистиллированной воды, учитывая поправочный коэффициент, равный отношению общей массы препарата к массе активного вещества. Например, если в таблетке массой 375 мг содержится 250 мг активного веществ, то поправочный коэффициент будет равен 1,5 (375 : 250). Тогда для приготовления раствора концентрацией 10000 мкг/мл необходимо 15 мг порошка, полученного из таблетки, растворить в 1 мл дистиллированной воды. В случае комбинированных препаратов (например, ко-тиметоприма) расчёт ведут по основному веществу (в данном случае триметоприму).

Далее готовят чашки Петри с предварительно автоклавированным и остуженным до 48–50°С питательным агаром, в который добавлены антибиотики, в двукратно увеличивающихся концентрациях. Для этого в стерильные флаконы наливают по 20 мл агара и добавляют в них необходимое количество рабочих растворов (Табл. 35.5), начиная с наименьшей концентрации, после чего тщательно перемешивают и выливают в чашку.

С другой стороны, к 18 мл агара можно прилить по 2 мл рабочего раствора антибиотика в заранее приготовленных серийных разведениях, тщательно перемешать и вылить в чашки Петри. Таким образом конечная концентрация препарата в агаре будет в 10 раз меньше, чем концентрация вносимых серийных разведений рабочего разведения.

473

Табл. 35.5. Концентрации антибиотических препаратов,

добавляемых в питательный агар

Примечание:

Для приготовления растворов препаратов в концентрациях 1000 мкг/мл и 10000 мкг/мл применяют димексид или 26%-ный раствор этилового спирта.

После высушивания чашки рекомендуется использовать немедленно или в течение суток, при условии хранения при 4–8°С. Непосредственно перед работой их подсушивают в течение 15 минут при 37°С, чтобы избежать образования конденсата. В качестве среды чаще всего используют агар Мюллера – Хинтон и реже агар Хоттингера.

Суспензию из суточной культуры чумного микроба в 0,85%-ном изотоническом растворе хлорида натрия (5 х 108 м. к./мл) наносят по каплям лёгким касанием пипетки (примерно 0,005 мл) на поверхность агара, начиная с наименьшей концентрации. Таким образом можно изучить до 20 штаммов (в том числе включить контрольный штамм, МПК для которого известны). Затем, через 10–15 минут, когда агар подсохнет, чашки (в том числе чашку без антибиотика для контроля роста культуры) инкубируют при 28°С. Предварительный учёт результатов проводят через 36 часов, а

474

окончательный – через 48 часов, при учёте характерного роста культуры на контрольной чашке. Учёт результатов осуществляют путём сравнения минимальной концентрации препарата, подавляющей рост возбудителя (т. е. МПК), с пограничными значениями, приведёнными в Табл. 35.1.

Как и в случае с дисками, препараты подлежат тестированию с помощью референс-штаммов на среде Мюллера – Хинтон.

По итогам тестирования обоими методами исследуемый микроорганизм относят к одной из категорий категории:

чувствительный, то есть применение антибиотика в рекомендуемых дозах приведёт к подавлению роста и размножения штамма;

промежуточный, то есть применение антибиотика приведёт к подавлению роста и размножения штамма только при максимально допустимых дозах, при этом не исключается отбор вариантов возбудителя, для которых даже максимальные дозы окажутся неэффективными;

устойчивый, то есть применение антибиотика в рекомендуемых дозах не приведёт к подавлению роста и размножения штамма, и, следовательно, использование этого антибиотика для лечения недопустимо.

Важно помнить, что клинически ориентированные категории чувствительности и проверенная устойчивость к антибиотикам не всегда коррелируют. Поэтому, даже если есть улучшение на фоне назначенной терапии, через двое-трое суток необходим бактериологический контроль эффективности этиотропной терапии (посев, биопроба).

475

Табл. 35.1. Допустимые диаметры зон подавления роста и значения МПК для исследуемой культуры

Примечание:

S – чувствительный, R – устойчивый. Значения МПК и диаметров зон между S и R свидетельствуют о промежуточной категории

476

Табл. 35.2. Допустимые диаметры зон подавления роста для контрольных штаммов

477

Табл. 35.3. Допустимые значения МПК для контрольных штаммов

478

36 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Исследования 1 Джéймса Уóтсона 2 , Фрэ нсиса Кри ка3 , Мóриса Уи лкинса4 (колл.) и Розали нд Фрáнклин5 (с колл.) позволили в 1953 году расшифровать структуру ДНК, что дало мощный толчок развитию молекулярной биологии и созданию молекулярногенетических методов исследования. Так, в 1971 году Хьéлль Клéппе6 (с колл.) опубликовал статью7, в которой предложил процесс репликации сегмента ДНК с помощью двух синтетических праймеров, назвав это репарационной репликацией. Однако его разработка не получила должного внимания со стороны научного сообщества, поэтому метод, который позволяет многократно последовательно удваивать исходный фрагмент молекулы ДНК, то есть амплифицировать ДНК, был предложен 8 только в 1983 году Кэ ри

1 Watson J. D., Crick F. H. C. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature. 1953; 171:737–738; DOI: 10.1038/171737a0; Wilkins M. H. F., Stokes A. R, et al. Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic Acids. Nature. 1953; 171:738–740; DOI: 10.1038/171738a0; Franklin R. E., Gosling R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 1953; 171(4356):740–741; DOI: 10.1038/171740a0.

2James Dewey Watson, р. 1928; американский биолог. Лауреат Нобелевской премии по физиологии или медицине (1962). Глава проекта «Геном человека» (The

Human Genome Project).

3Francis Harry Compton Crick, 1916–2004; британский и американский физик. Во время Второй мировой войны занимался разработкой магнитных и акустических мин. В 1947 году перешёл, как сам позже писал, от элегантности и глубокого понимания физики в сложные химические механизмы, естественный отбор которых развивался в течение миллиардов лет, ввиду чего ему пришлось почти заново родиться.

4Maurice Hugh Frederick Willkins, 1916–2004; новозеландский и британский фи-

зик ирландского происхождения. Лауреат Нобелевской премии по физиологии или медицине (1962).

5Rosalind Elsie Franklin, 1920–1958; британский биофизик еврейского происхождения, рентгенограф.

6Kjell Kleppe, 1934–1988; норвежский химик и молекулярный биолог.

7Kleppe K., Ohtsuka E. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. J Mol Biol. 1971; 56(2):341–361;

DOI: 10.1016/0022-2836(71)90469-4.

8 US 4683195 A, 28.07.1987; сведения о годе разработки метода указаны согласно персональному сайту (https://www.karymullis.com/pcr.shtml).

479