Опера о чуме (учебник)

В качестве дополнительного метода используют реакцию гемагломерации. Для этого в чашке Петри двухсуточную культуру, выращенную при 37°С, петлёй или в виде суспензии (109 м. к./мл) смешивают с 0,05 мл (одна капля) чумного антительного (иммуноглобулинового) эритроцитарного диагностикума и через 5–7 минут при помощи вогнутого зеркала проводят учёт реакции. Оценку результатов проводят по системе четырёх крестов:

Рассмотрим ещё один метод, именуемый реакцией коагглютинации (Ко-А), основанный обнаруженной 1 в 1939 году Сэ муелем Кóуэном2 способности белка А клеток золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus Cowan 1) адсорбировать антитела класса G. Механизм этого процесса заключается в том, что белок А, за счёт изменений в гене spa, имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому если обработать такие клетки иммунной сывороткой, они будут неспецифически адсорбироваться антителами, которые, в свою очередь, будут агглютинировать с антигенами. Данный метод не применялся в лабораторной диагностике чумы до 1972 года, когда Нина Васильевна Божкó выделила3 фракцию V (FV-антиген) из бесфракционных штаммов чумного микро-

1Cowan S. T. Classification of staphylococci by slide agglutination. J Pat Bacteriol. 1938; 48(1):169–173; DOI: 10.1002/path.1700480117.

2Samuel Tertius Cowan, 1905–1976; британский врач, бактериолог.

3Божко Н. В. Получение диагностических препаратов на основе антигенов чумного микроба, выделенных поверхностно-активными веществами. Автореферат дис. … кандидата биоло-

гических наук. Ростов-на-Дону, 1972, 23 с.

440

ба1. Если затем этой фракцией иммунизировать кроликов, то можно получить IgG-анти-FV-антисыворотку, чтобы использовать в составе как Ко-А диагностикума, так и в реакциях агглютинации для идентификации бесфракционных штаммов чумного микроба (поскольку они не синтезируют капсульный антиген) и их дифференцировки с псевдотуберкулёзным.

Интересно, что в отличие от капсульного антигена синтез фракции V не зависит от температуры культивирования, а белок в её составе, имеющий наибольшую иммунную активность, идентифицирован2 как кодируемый геном tal фермент трансальдолаза (Tal). Аналогичный ген отвечает за синтез трансальдолазы у Y. pseudotuberculosis, только, в отличие от чумного микроба, у различных штаммов псевдотуберкулёзного встречаются его вариации, но всего в 6–9 нуклеотидов (около 1%). При этом в случае максимального отличия в 9 нуклеотидов (Y. pseudotuberculosis IP31758) разница в аминокислотной последовательности с таковой у возбудителя чумы будет всего в одну аминокислоту (в 57 положении у Y. pestis находится аланин, а у Y. pseudotuberculosis – треонин). Причина, по которой при идентичных трансальдолазах антитела к фракции V агглютинируют только чумной микроб, вероятно, кроется в строении ЛПС псевдотуберкулёзного микроба, который экранирует доступ антител к фракции V.

1 Способ получения: к 100 мл бактериальной взвеси (109 м. к./мл) в физиологическом растворе добавляют дезоксихолат натрия до конечной концентрации 0,005%, после чего шуттелируют (т. е. встряхивают при режиме встряхивания не менее 50– 60 колебаний в минуту) при комнатной температуре 3 часа. Затем центрифугируют полчаса (10000 об/мин) при 4–8°С. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 100 мл физиологического раствора и повторяют описанные действия четыре раза, добавляя последовательно дезоксихолат натрия до конечных концентраций 0,02%, 0,08%, 0,32% и 1,28%. К полученному супернатанту (пятой фракции) добавляют 5 объёмов ацетона, охлаждённого до минус 20°С, и оставляют при минус 20°С на 18–20 часов для формирования осадка. Затем осадок растворяют в 50 мл дистиллированной воды и отделяют методом диализа 4–5 суток. Полученную фрак-

цию V хранят лиофильно высушенной или разлитой при минус 20°С.

2 Трухачёв А. Л., Копылов П. Х., и др. Трансальдолаза – один из наиболее иммунологически активных компонентов препарата «фракция V» Yersinia pestis, в сб. IX Всероссийская науч- но-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика – 2017», под ред. В. И. Покровского. Тамбов: ООО фирма «Юлис», 2017, 544 с.

441

В 1946 году Анатолий Тимофеевич Крáвченко 1 и Михаил Игнатьевич Соколóв2 показали3, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы полисахаридные антигены, приобретают способность агглютинироватася в присутствии гомологичных сывороток. Это стало началом развития гемагглютинационных тестов, которые применяют в тех случаях, когда выделение чистой культуры возбудителя затруднено.

Реакция непрямой (РНГА) или пассивной (РПГА) гемагглютинации

основана на способности специфического склеивания (гемагглютинации) эритроцитов, сенсибилизированных (нагруженных) специфическим антигеном или антителом, с материалом, содержащим соответственно специфическое антитело или антиген. При этом результат реакции наблюдается в виде выпадения на дно лунки планшета склеенных эритроцитов.

Пробоподготовка аналогична таковой для ИФА за тем исключением, что поскольку обычно в крови больных содержится сравнительно малое количество капсульного антигена, 150 мкл обеззараженного материала прогревают полчаса при 75°С (а не 15 минут при 65°С). Затем, если образовался осадок, пробу центрифугируют в течение 2–3 минут при 1000 об/мин.

Для постановки в восемь лунок U-образного планшета вносят по 50 мкл разводящей, после чего в первую лунку вносят 50 мкл исследуемого материала, содержащего антиген, или сыворотки крови, содержащей антитела, в разведении 1:10 и титруют до седьмой лунки. Затем во все восемь лунок добавляют по 25 мкл чумного эритроцитарного диагностикума (антительного или антигенного), который предварительно встряхивают. Планшет аккуратно встряхивают для перемешивания компонентов и выдерживают 2 часа при комнатной температуре или полчаса при 37°С. Схема метода для обнаружения антигена приведена в Табл. 33.3, для обнаружения антитела – в Табл. 33.4.

1Советский (российский) врач, вирусолог. Первый директор НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского (ныне входит в состав НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи).

21908–1975; советский (российский) врач, вирусолог.

3Кравченко А. Т., Соколов М. И. Адсорбция специфических полисахаридов бактерий эритроцитами человека. Журнал микробиологии. 1946; 12:10–16.

442

Табл. 33.3. Схема постановки РНГА-Аг

Инкубация при комнатной температуре (2 часа) или при 37°С (полчаса)

Табл. 33.4. Схема постановки РНГА-Ат

Инкубация при комнатной температуре (2 часа) или при 37°С (полчаса)

1 Традиционно для постановки гемагглютинационных тестов с бактериальными культурами (материалом, содержащем антиген) используют 1%-ную нормальную кроличью сыворотку, поскольку действие антигенов, вызывающих аутоагглютинацию, устраняется на этапе пробоподготовки. Однако в случае чумного микроба пробоподготовка не позволяет полностью устранить действие фактора аутоагглютинации (ФА), ввиду чего необходимо использовать либо нормальную кроличью сыворотку в более высоких концентрациях, либо предварительно инкубировать образцы в 1%-ной кроличьей анти-ФА сыворотке в течение часа.

443

Рис. 33.4. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (верхний ряд) и реакция непрямой (пассивной) латексной агглютинации (нижний ряд)

Постановка считается валидной, если в контроле отсутствует гемагглютинация, то есть видны маленькие колечки или пуговки на дне лунки. При положительном результате в первых или во всех лунках эритроциты располагаются на дне равномерным слоем (зонтики), а при отрицательном – во всех лунках отсутствует гемагглютинация. Сомнительным считают такой результат, при котором в лунках визуализируются колечки (пуговки) несколько большего диаметра, чем в контроле (Рис. 33.4). В ряде случаев это может происходить из-за того, что в исследуемом материале содержится незначительное количество специфических антител, поэтому с целью контроля специфичности параллельно с РНПА

(РПГА) ставят реакцию торможения непрямой (пассивной) гемагглю-

тинации (РТНГА, РТПГА). Суть этой реакции заключается в специфическом подавлении (торможении) гемагглютинации путём добавления к разведениям исследуемого материала специфической сыворотки или убитой культуры в количестве до 20 единиц.

Для определения сывороточной (СЕ) и антигенной (АЕ) единиц в восемь лунок планшета вносят по 25 мкл разводящей жидкости, после чего с первой по седьмую титруют по 25 мкл чумной агглютинирующей сыворотки (1:10000) или взвеси чумного микроба (108 м. к./мл) и добавляют во все восемь лунок по 25 мкл чумного эритроцитарного диагностикума (антигенного или антительного соответственно). Планшет выдерживают 2 часа при комнатной температуре или полчаса при 37°С. Схема метода определения СЕ приведена в Табл. 33.5, определения АЕ – в Табл. 33.6.

444

Разведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов, сенсибилизированных специфическим антигеном, принимают за 1 СЕ (1 АЕ), а разведение в предшествующей лунке – за 2 СЕ (2 АЕ).

Для постановки РТНГА (РТПГА) в восемь лунок планшета вносят по 25 мкл разводящей жидкости, после чего с первой по седьмую титруют по 25 мкл исследуемого материала или сыворотки в разведении 1:10 и добавляют во все восемь лунок по 25 мкл специфической иммунной сыворотки активностью 8–16 СЕ или взвеси убитой культуры активностью 8–16 АЕ. Далее планшет выдерживают полчаса при 37°С и во все лунки добавляют по 25 мкл эритроцитарного диагностикума (антительного или антигенного соответственно). Схема метода для обнаружения антигена приведена в Табл. 33.7, для обнаружения антитела – в Табл. 33.8.

Учёт результатов проводят как для РНГА (РПГА). Если активность исследуемого материала (сыворотки) отсутствует или значительно снижена (на 4–5 лунок) относительно РНГА (РПГА), то результат РНГА (РПГА) признаётся специфичным.

Табл. 33.7. Схема постановки РТГА-Аг

Инкубация при комнатной температуре (2 часа) или при 37°С (полчаса)

446

Табл. 33.8. Схема постановки РТГА-Ат

Инкубация при комнатной температуре (2 часа) или при 37°С (полчаса)

Аналогичным образом проводят реакции латексной агглютинации, в которых вместо эритроцитов применяют полистироловые или полиакролеиновые латексные частицы диаметром 1,2–1,8 мкм, а в качестве разводящей жидкости используют фосфатнобуферный раствор. Схемы методов и учёт результатов (Рис. 33.4) аналогичны как для РНГА (РПГА) и РТНГА (РТПГА).

В случае изучения объектов внешней среды в разводящую жидкость дополнительно добавляют белковый сенсибилизатор в разведении 1:1001 и твин-80 в концентрации 1:80000.

Вернёмся к реакциям гемагглютинации. В исследуемых пробах крови могут содержаться антитела и антигены, которые могут влиять на результат описанных ранее реакций. Чтобы исключить действие антител или антигенов, применяют соответственно реакцию

1 Способ приготовления: к 25 мл белка куриного яйца добавляют 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г гидрокарбоната натрия, после чего перемешивают 10– 15 минут, прогревают 40–60 минут при 56°С и фильтруют (см. RU 2198407 C2, 10.02.2003).

447

нейтрализации антигена (РНАг) и реакцию нейтрализации антитела

(РНАт). Суть этих реакций заключается в том, что добавленные антитела активностью 2 СЕ (или антигены активностью 2 АЕ) нейтрализует действие антигенов (антител), находящихся в пробе.

Для постановки в восемь лунок планшета вносят по 25 мкл разводящей жидкости, после чего с первой по седьмую титруют по 25 мкл исследуемого материала или сыворотки в разведении 1:10 и добавляют во все восемь лунок по 25 мкл специфической иммунной сыворотки активностью 2 СЕ или взвеси убитой культуры активностью 2 АЕ. Далее планшет выдерживают полчаса при 37°С и во все лунки дабавляют по 25 мкл эритроцитарного диагностикума (антительного или антигенного соответственно). Можно видеть, что описанная методика очень похожа на методику постановки РТНГА (РПНГА). Схема метода для обнаружения антигена приведена в Табл. 33.9, для обнаружения антитела – в Табл. 33.10.

Табл. 33.9. Схема постановки РТНГА-Аг

Выдерживать при комнатной температуре (2 часа) или при 37°С (полчаса)

448

Табл. 33.10. Схема постановки РТНГА-Ат

Выдерживать при комнатной температуре (2 часа) или при 37°С (полчаса)

Если в исследуемом материале (сыворотке) содержатся антитела (антигены), то они нейтрализуют антигены активностью 2 АЕ (антитела активностью 2 СЕ) и уже не смогут агглютинировать антигены (антитела) диагностикума. Результат такой реакции будет отрицательным (пуговка). В обратной ситуации, когда в исследуемом материале (сыворотке) не содержатся антитела (антигены), добавляемые антигены активностью 2 АЕ (антитела активностью 2 СЕ) будут агглютинировать антигены (антитела) диагностикума и результат реакции будет положительным (зонтик). Таким образом, для реакций РНАг и РНАт положительным будет считаться отрицательный результат в лунке (пуговка) и, соответственно, валидной будет считаться реакция, в которой произошла агглютинация контроля.

Для характеристики эпизоотического процесса важно определить класс иммуноглобулинов в сыворотке крови или смывах, взятых по методике, описанной в Главе 29, для чего сыворотку крови обрабатывают равным объёмом 2-меркаптоэтанола, что приводит к разрушению дисульфидных связей в IgM и, как следствие, его дис-

449