Опера о чуме (учебник)

ведению, в котором обнаруживается рост культуры (т. е. последняя «чистая»), и является искомым титром (его называют титр по Ап-

пельману).

Разновидностью этого метода является метод диагностических рабочих разведений. Дно чашки Петри с 1,5–2%-ным агаром расчерчивается для удобства на 8 секторов (можно взять несколько чашек Петри, разделённых на меньшее количество секторов). В пробирку с 4,5 мл 0,7%-ного агара, предварительного расплавленного и остуженного до температуры 47°С, вносится 0,2 мл культуры, инкубированной 18–20 часов при температуре 28°С, перемешивается и выливается на чашку Петри1. Данная манипуляция представляет большую опасность, поэтому перед открытием пробирки её проверяют на целостность. Если расплавление агара осуществлялось на водной бане, то пробирку следует обтереть. Далее полужидкий агар перемешивают в пробирке, производя медленные круговые движения, вынимают пробку, при этом напарник приоткрывает крышку чашки. Пробирку подносят максимально близко к агару, чтобы избежать разбрызгивания, и полужидкий агар осторожно выливают на его поверхность, после чего напарник закрывает чашку крышкой, оставляя небольшое отверстие для подсушивания. Сотрудник, выливавший агар, аккуратно вставляет пробку в пробирку, предварительно подобрав ею капли агара, которые могли остаться на краю пробирки, после чего закрытая пробирка отдаётся на автоклавирование2. Затем на каждый сектор застывшего и хорошо подсохшего агара вносится по 0,05 мл (одна капля) бактериофага цельного и в разведениях (от 10-1 до 10-7). Допустимо вносить бактериофаг с помощью петли диаметром 2 мм, каждый раз её обжигая. При этом следует следить, чтобы на петле не оставалось жидкости, поскольку при обжиге она может разбрызгаться. Далее чашкам дают подсохнуть и, перевернув, инкубируют сутки при 28°С. Как и в случае титра по Аппельману, последний сектор, на котором обнаруживается пятно лизиса, и является искомым диагностическим рабочим титром (ДТР).

1Некоторые специалисты вместо этого вносят 0,1 мл культуры на поверхность агара и тщательно растирают её шпателем.

2При транспортировке пробирки следует накрыть салфеткой, смоченной раствором дезинфектанта, а автоклавирование провести в тот же день.

420

Иной метод был предложен Андрé Грáция1, который на момент заседания Биологического общества являлся сторонником Жюля Борде, но впоследствии убедился в правоте воззрений Ришара Брюинога. Его метод заключается в том, что в пробирки с 4,5 мл бульона вносят по 0,5 мл разведения бактериофага (как правило, от 10-1 до 10-7) и 0,05 мл (одна капля) бактериальной культуры (примерно 109 м. к./мл), после чего выливают на пластинки с 1,5%-ным агаром Хоттингера, подсушивают и инкубируют при 28°С. В результате на сплошном бактериальном газоне появляются стериль-

ные пятна, называемые негативными колониями бактериофага

(Рис. 32.1). Их число соответствует количеству фаговых частиц.

1 мл (20 х 108/мл)2.

Наряду с количественными методами, позволяющими определить концентрацию бактериофага, необходимую для лизиса культуры, применяют качественные, который позволяют ответить на вопрос, лизируется ли культура данным бактериофагом. Поэтому в вопросах диагностики, когда важно выдать результат как можно быстрее, определение чувствительности культуры к бактериофагам начинают с качественных методов.

1André Gratia, 1893–1950; бельгийский врач, бактериолог. Первый исследователь бактериофагов в США.

2Для точности подсчёт ведут на нескольких чашках, вычисляя результат как среднее арифметическое. Если на чашке много негативных колоний, то её можно разделить на сектора, посчитать количество негативных колоний в секторе и умножить на количество секторов.

421

сектора и инкубируют при 28°С. Предварительный учёт результатов (наличие лизиса в месте нанесения бактериофага) осуществляют через 12 часов, а окончательный – через 24 часа (Рис. 32.2).

Существует также ускоренный метод, согласно которому на первую чашку со средой Туманского наносят по 0,05 мл (одна капля) исследуемой культуры и бактериофага, растирая их шпателем по поверхности. На вторую чашку со средой Туманского засевают исследуемый материал, а у самого края чашки наносят одну каплю (0,05 мл) бактериофага, давая ей стечь до другого края, образовав «дорожку». Каплю бактериофага следует наносить на хорошо подсушенный агар пастеровской пипеткой (касаясь концом агара) или петлёй, чтобы исключить разбрызгивания. Наконец, на третью чашку со средой Туманского засевают только исследуемый материал. Все чашки инкубируют сутки при 28°С. При положительном результате на первой чашке обнаруживаются стерильные пятна, на второй – стерильная «дорожка» (в месте нанесения бактериофага),

ина третьей – бактериальные колонии (контроль).

Вдиагностических целях используются различные литические бактериофаги, активные в отношении чумного микроба. Чаще всего они осуществляют связывание с некоторым участком кора ЛПС (Табл. 32.1, Рис. 32.3). В России и странах бывшего СССР применяют бактериофаг Покровской, выделенный1 Магдаленой Петровной

1 Покровская М. П. Бактериофаг и его практическое применение для лечения и профилактики летних детских поносов, дизентерии и хирургических инфекций. Пятигорск: Крайведиз-

дат, 1940.

422

Покровской в 1929 году из тканей, заражённых чумой сусликов рода Spermophilus и относящийся к серовару 1 (семейство Podoviridae), а также бактериофаг Л-413С (вирулентный мутант умеренного бактериофага Л-413), относящийся к серовару 2 (семейство Myoviridae). Бактериофаг Покровской является близкородственным колифагу Т7 (активен в отношении Escherichia coli), менее специфичен, и в зависимости от разведения лизирует 92,5–98,5% культур Y. pestis и 6,1–19% культур Y. pseudotuberculosis. Поэтому его применяют только, когда подозрительная культура не лизируется бактериофагом Л-413С и в параллели с псевдотуберкулёзным бактериофагом. Положительный результат в этой ситуации регистрируется только в случае лизирования культуры диагностическим рабочим титром и выше, то есть лизируется меньшей концентрацией бактериофага (вот тут в игру вступают количественные методы)1.

В США применяют бактериофаг ϕА1122, выделенный 2 в 1933 году из крови больного бубонной чумой и относящийся к серовару 1 (семейство Podoviridae). Интересно, что данный бактериофаг, как и бактериофаг Покровской, является близкородственным колифагу Т7. Лизирует культуры чумного микроба при 20 и 37°С, а также культуры Y. pseudotuberculosis при температурах выше 28°С. Кроме того, применяют бактериофаг Р, выделенный3 в 1951 году и бактериофаг Н, выделенный4 в 1953 году из сточных вод Калифорнийского университета в Беркли, который лизирует культуры чумного микроба при 20°С. Интересно, что оба бактериофага относятся к серовару 1 (семейство Podoviridae) и способны лизировать Escherichia coli, как и бактериофаг Y, выделенный5 в 1964 году в Израиле

1Если лизис происходит в разведении ниже ДРТ (т. е. большей концентрацией бактериофага), то переходят к иным диагностическим методам.

2Advier M. Etude d'un bactériophage antipesteux. Bull Soc Pathol Exotiques. 1933; 26:94–

99.

3 Gunnison J. B., Larson A., et al. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 1951; 88(3):254–255; DOI: 10.1093/infdis/88.3.254.

4 Cavanaugh D. C., Quan S.F. Rapid identification of Pasteurella pestis using specific bacteriophage lyophilized on strips of filter paper; a preliminary report. Am J Clin Pathol. 1953; 23(6): 619–620.

5 Hertman I. Bacteriophage common to Pasteurella pestis and Escherichia coli. J Bacteriol. 1964; 88:1002–1005; DOI: 10.1128/jb.88.4.1002-1005.1964.

423

Рис. 32.3. Химические структуры кора ЛПС Y. pestis при 27°С и 37°С (по Книрель Ю. А., 2012) с отмеченными на них участками, распознаваемыми бакте-

риофагами Покровской (П), Л-413С (L413C), ϕА1122 (А1122), Yepe2, P2 vir1, JA1, T7Yp (T7) и Y. Обратите внимание, что большинством бактериофагов распознаётся участок кора HepI/Glc. Кроме того, бактериофаг JA1 распознаёт участок кора только в модификации при 27°С, а бактериофаг ϕА1122 при этой модификации имеет только один участок распознавания

из «мутных бляшек», образовавшихся на культуре чумного микроба при 27°С.

Вполне вероятно, что внимательного читателя заинтересует бактериофаг Н в том смысле, что ранее (в Главе 6) мы говорили про бактериофаг с таким же названием, выделенный в 1965 году Нико-

424

риофагов продолжается. Так, в 2023 году были выделены 1 новые бактериофаги YpEc56, YpEc56D, YpEc57, YpEc58, YpEc1, YpEc2, YpEc11 и YpYeO9 (Рис. 32.5), относящиеся к серовару 1 (семейство Podoviridae). Проведённые исследования показали высокую спецфичность только бактериофагов YpEc11 и YpYeO9, а результаты полногеномного секвенирования позволили их идентифицировать как новый вид семейства Autographiviridae.

Табл. 32.1. Участки кора ЛПС чумного микроба,

распознаваемые различными диагностическими бактериофагами

Несколько лет назад был предложен2 интересный метод обнаружения чумного микроба, основанный на способности бактериофагов связываться с бактерией посредством рецепторсвязываю-

щих белков (RBP; receptor binding proteins). В частности, были по-

лучены рецепторсвязывающие белки бактериофагов Л-413С и ϕА1122, чьи гены gpH и gp17 рецепторсвязывающих белков были слиты с генами флуоресцентных белков mCherry и eGFP, что позволило получить флуоресцентные белки mCherry-RBP и eGFP-RBP названных бактериофагов, и с их помощью обнаруживать клетки Y. pestis методами флуоресцентной микроскопии (Рис. 32.6). Данный метод оказался простым и быстрым, но, что важнее, высоко-

1 Suladze T., Jaiani E., et al. New Bacteriophages with Podoviridal Morphotypes Active against Yersinia pestis: Characterization and Application Potential. Viruses. 2023; 15(7):1484; DOI: 10.3390/v15071484.

2 Born F., Braun P., et al. Specific Detection of Yersinia pestis Based on Receptor Binding Proteins of Phages. Pathogens. 2020; 9(8):611; DOI: 10.3390/pathogens9080611.

426

специфичным 1 , причём белки бактериофага Л-413С показали большую специфичность, чем белки бактериофага ϕА1122, поскольку последние, как и сам бактериофаг, могут связываться с Y. pseudotuberculosis при 37°С. Кроме того, наличие капсулы не оказывало значительного влияния на способность mCherry-RBP бактериофага Л-413С связываться с бактериальной клеткой.

▲ Рис. 32.5. Бактериофаги YpEc1 (а), YpYeO9 (b), YpEc56D (c), YpEc58 (d), YpEc57 (e), YpEc2 (f), YpEc11 (g) и YpEc56 (h); просвечивающая электронная

микроскопия, ув.40000х (по Suladze T., 2023)

▼ Рис. 32.6. Флуоресцентная микроскопия белков mCherry-RBP (а) бактерииофага Л-413С и eGFP-RBP (b) бактериофага ϕА1122 (по Born F., 2020)

1 Тут следует, однако, заметить, что приобретаемая бактерией резистентность к рецепторсвязывающим белкам бактериофагов ставит под угрозу специфичность данного метода, впрочем, как и любого метода на основе диагностических бактериофагов в целом, поэтому к отрицательным результатам по бактериофагам следует относиться весьма настороженно.

427

33 ИММУНОХИМИЯ: АНТИГЕН – АНТИТЕЛО

В 1944 году Арчер Мáртин1 и Ри чард Си ндж2 создали метод, позволивший на тонком целлюлозном носителе разделить смесь аминокислот. Новый метод получил название бумажная хроматография. Уже через год на его основе был создан иммунохроматографический анализ (ИХА, LFT, от англ. lateral flow test)3, позволяющий быстро и просто обнаруживать присутствие целевого вещества (антигена) в жидкой пробе.

Принцип действия ИХА состоит в том, что при попадании анализируемой жидкости на нижнюю часть полоски она начинает мигрировать, соединяясь с мечеными антителами. При этом различают две формы анализа – прямую («сéндвич») и конкурентную.

В первом случае исследуемая проба (аналит), содержащая антиген (Аг), связывается с конъюгатом – меченым антителом, как правило, коллоидным золотом (Ат*). По мере движения образованный комплекс встречает первый барьер, где связывается со специфическими антителами (Ат), образуя «сендвич»: Ат – Аг – Ат*. Избыток конъюгата (Ат*) движется дальше, встречая второй барьер, где связывается с антителами (Ат’) к этому конъюгату: Ат’ – Ат*. В итоге, если проба (аналит) содержит антиген, цветные метки (Ат*) будут задержаны обоими барьерами, а если не содержит – то только вторым барьером. Визуально это будет идентифицироваться как одна и две полоски (как правило, барьеры отмечают буквами «Т» – тест и «С» – контроль). Таким образом, любой результат, где отсутствует полоска контроля (говорят: не проходит контроль) следует считать невалидным (т. е. недействительным). Данная форма ИХА применяется для идентификации высокомолекулярных соединений, таких как антигены возбудителей инфекционных заболеваний и гормоны.

1Archer John Porter Martin, 1910–2002; британский химик. Лауреат Нобелевской премии по химии (1952).

2Richard Laurence Millington Synge, 1914–1994; британский биохимик. Лауреат

Нобелевской премии по химии (1952).

3 Consden R., Gordon A. H., et al. Qualitative analysis of proteins: a partition chromatographic method using paper. Biochem J. 1944; 38(3):224–232; DOI: 10.1042/bj0380224.

428

Во втором случае исследуемая проба (аналит), содержащая антиген (Аг), также связывается с конъюгатом (Ат*), но поскольку имеет только один центр связывания, уже не может связаться с антителами (Ат) первого барьера, при этом избыток конъюгата (Ат*), достигая второго барьера, связывается с антителами (Ат’) к этому конъюгату. В итоге, если проба (аналит) содержит антиген, цветные метки (Ат*) будут задержаны только вторым барьером (Ат’ – Ат*), а если не содержит – то обоими барьерами. Таким образом, как и в первом случае, любой результат, где отсутствует полоска контроля, следует считать невалидным, но в отличие от первого случая отрицательным будет считаться результат, где визуализируются две полоски. Данная форма ИХА применяется для идентификации низкомолекулярных соединений, таких как метаболиты наркотических соединений, содержащиеся в моче и жидкости ротовой полости.

В случае чумного микроба применяют ИХА первой формы, используя в качестве специфической мишени (искомого антигена) капсульный антиген. Простота использования системы даёт возможность быстрого (в течение 20 минут) выявления и идентификации не только непосредственно клеток чумного микроба, но и их «следов» (капсульного антигена) из объектов окружающей среды. Не зря этот тест, наравне с МФА, является обязательным в критериях определения случая чумы (вероятный и подтверждённый случаи) Всемирной организации здравоохранения.

Сам тест представляет собой диагностическую панель с лункой для внесения образца, а также зонами «Т» и «С» для визуальной оценки результатов. С точки зрения биологической безопасности располагают панель в чашке Петри для предотвращения возможной аварии. В качестве меченых антител используются как поликлональные антитела, так и моноклональные. Чувствительность тест-системы на основе поликлональных антител составляет 106 м. к./мл или 0,1 мкг/мл для капсульного антигена. В случае моноклональных антител – 103 м. к./мл или 0,004 мкг/мл для капсульного антигена, однако исследования1 показывают, что в случае ис-

1 Hsu H.-L., Chuang C.-C., et al. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis by lateral-flow assay in simulated clinical samples. BMC Infect Dis. 2018; 18:402; DOI: 10.1186/s12879-018- 3315-2.

429