Опера о чуме (учебник)

кажущиеся на первый взгляд устаревшими, не теряют своей актуальности. Остановимся на них подробнее.

Исследование на ферментацию углеводов и спиртов («пёстрый ряд») проводят для оценки способности микроорганизма фермен-

сутки инкубируют при оптимальной для микроорганизма температуре (в случае чумного микроба – при 28°С), хотя на практике не все пробирки «срабатывают», что зависит от среды, индикатора и «личных» предпочтений микроорганизма.

1Предложен американским бактериологом Е. П. Андреде (1872–1906). Способ приготовления: растворяют 0,5 г фуксина в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 15 мл NaOH. Когда через 24 часа цвет раствора изменится с красного на коричневый, по каплям добавляют NaOH до конечной рН 7,1–7,2 (цвет раствора становится соломенно-жёлтым).

2Здесь и далее следует помнить, что в медицинской практике возможно использовать только зарегистрированные в установленном законом порядке медицинские изделия!

400

При положительной реакции, когда в качестве индикатора используется феноловый красный, среда меняет окраску с розовокрасного цвета на жёлтый.

Исследование на фер-

ментацию глицерина куль-

турой чумного микроба рекомендуется проводить на твёрдой питательной среде, поскольку в жидкой его расщепление запаздывает, и это может привести к получению ложноотрицательного результата. Поэтому суточную культуру высевают на агар Коля – Бельку ра (площадкой или полоской) и инкубируют при 28°С до трёх суток. При положительной реакции культура растёт в виде красно-рыжих колоний

(Рис. 31.2), достаточно часто окрашивая и агар в зоне посева (при отрицательной реакции культуры серовато-белые).

В начале этой книги (Глава 3) мы говорили, что штаммы, выделяемые в очагах, где основными носителями являются крысы (bv. orientalis) 1 , не способны ферментировать глицерин 2 , и что именно это легло в основу первой внутривидовой классификации чумного микроба, предложенной Анной Артемьевной Безсоновой. Тут следует сказать, что существуют штаммы, диссоциирующие по признаку ферментации глицерина, то есть формирующие коло-

1Чума, вызванная этими штаммами, некоторое время именовалась «городской».

2За способность ферментировать глицерин отвечает кодируемый геном glpD фермент глицерол-3-фосфат дегидрогеназа (GlpD). Делеция этого гена в рамке считывания размером 0,093 Кб (93 п. о.) приводит к удалению 31 аминокислоты в пределах N-концевой последовательности кодируемого фермента и, как следствие, утрате признака.

401

нии, как способные, так и не способные ферментировать глицерин

(Рис. 31.3).

Вместе с тем ферментация глицерина не единственное биохимическое свойство, присущее подвидам чумного микроба и пред-

ставляющее определённый интерес для внутривидовой дифференциации. Так, штаммы неосновных подвидов являются рамнозопозитивными (т. е. ферментирующими рамнозу; Rha+), что связывается с экологической адаптацией бактерии к определённым видам носителей (полёвкам, монгольским пищухам) 1 . Напомним, что именно этот признак даёт ложноотрицательный результат на хромогенной питательной среде (относит к

Y. pseudotuberculosis) 2 . Вместе с тем улегейские штаммы, циркулирующие в природных очагах Монголии, ферментируют рамнозу, только если в среде её содержится не менее 1%, при этом возможно спонтанное появление Rha- -мутантов (и наоборот). И поскольку способность ферментировать рамнозу напрямую связана со способностью ферментировать мелибиозу (Mel+), это правило распространяется и на неё.

Кроме того, рамнозопозитивные «полёвочьи» штаммы, выделяемые в Горном Алтае и на Гиссарском хребте из полёвок (отсюда и название), ранее называемые «монгольскими», не способны ферментировать арабинозу (Ara-), однако при длительном инкубиро-

1У «полёвочьих» штаммов, в отличие от «классических» Rha--штаммов, как и штаммов Y. pseudotuberculosis, в гене rhaS имеется аденин (вместо гуанина) в положении 671 п. н.

2Наличие штаммов чумного микроба, сходных с псевдотуберкулёзным, привело

ктому, что в 1964 году было предложено выделить самостоятельный подвид semiplenus, а в 1969 году – самостоятельный вид Y. pestoides, включаюший подвиды parvocaucasica, altaica и transbaicalica!

402

вании (до месяца) около половины из них восстанавливает это свойство.

Принято считать, что все штаммы чумного микроба не способны ферментировать лактозу, однако благодаря наличию β- галактоидазы, находящейся обычно в неактивном состоянии, некотоые всё же способны ферментировать лактозу на 50-е сутки!

Исследование на способность разжижать желатин (протеолитическую активность) проводят с помощью желатиновой среды разлитой в пробирки «столбиком». Посев материала осуществляют проколом среды строго по центру, не доходя одного сантиметра до дна пробирки, после чего инкубируют 24-48 часов при комнатной температуре, наблюдая, при положительной реакции, разжижение среды по месту прокола. Если инкубировать посевы при 35°С (желатин при этой температуре становится жидким), то после охлаждения не произойдёт затвердевания.

Индольный тест используют для оценки способности бактерии расщеплять триптофан. Для постановки теста культуру инкубируют в бульоне или агаре, содержащем триптофан. Это могут быть пептон, панкреатический ферментативный гидролизат казеина, триптиказо-соевый агар и иные. В случае бульона культуру инкубируют 18–24 часов при 28°С, после чего 2 мл переносят в отдельную пробирку. Добавляют 5 капель реактива Ковача1 или реактива Эрлиха 2 (в последнем случае предварительно добавляют 0,5 мл ксилена) и хорошо встряхивают пробирку.

При положительной реакции на границе реактива и бульона буквально на несколько секунд образуется кольцо ярко-красного цвета.

1Способ приготовления: растворяют 1 г р-диметиламинобензальдегида в 95 мл 95%-ного раствора этилового спирта и медленно под вытяжным шкафом добавляют 20 мл концентрированной соляной кислоты, постоянно помешивая. Готовый реагент имеет бледно-жёлтый цвет и при хранении при 2–8°С хранится год.

2Способ приготовления: растворяют 10 г р-диметиламинобензальдегида в 150 мл изобутилового или изоамилового спирта и медленно под вытяжным шкафом добавляют 50 мл концентрированной соляной кислоты, постоянно помешивая. Готовый реагент имеет бледно-жёлтый цвет и при хранении при 2–8°С хранится год.

403

В случае агара на новую чашку Петри кладут фильтровальную бумагу, смоченную реактивом Эрлиха или Ковача, на которую петлёй с агара переносится ночная культура.

При положительной реакции, после растирания культуры, на бумаге в течение 30 секунд появляется яркое розово-красное окрашивание1.

Для исследования на ферментацию лактозы используют ONPGтест. Ферментация лактозы осуществляется с помощью пермеазы, обеспечивающей перенос лактозы внутрь бактериальной клетки, и b-галактозидазы, осуществляющей расщепление лактозы на галактозу и глюкозу. О-нитрофенил-b-D-галактопиранозид (ONPG) сходен по структуре с лактозой, поэтому в присутствии b- галактозидазы расщепляется на галактозу и О-нитрофенил (компонент жёлтого цвета). В прогретый при 37°С на водяной бане, чтобы растворить образовавшиеся во время хранения раствора соли, ONPG-бульон добавляют густую бактериальную суспензию (цвета молока) и инкубируют при 28°С не менее часа (не более суток). При положительном результате появляется жёлтое окрашивание.

Сероводородный тест применяют для исследования способности бактерий ферментировать серосодержащие аминокислоты (цистин, цистеин и метионин) и некоторые неорганические соединения до серы, которая, взаимодействуя с водородом, и образует сероводород. Он, в свою очередь, способен реагировать с некоторыми солями железа и свинца, что и лежит в основе теста. Для постановки используют железосодержащие питательные среды (например, агар Олькени цкого, агар Кли глера) и индикаторные полоски с ацетатом свинца2.

При положительной реакции среда окрашивается в чёрный цвет, а полоска, свободно свисающая над культурой3, окрашивается

1Для данного метода нельзя использовать среды, содержащие индикатор (например, МакКонки, Эндо), поскольку их перенос на индикаторную бумагу может дать неопределённый результат.

2Приготавливается путём пропитывания полосок фильтровальной бумаги раствором, содержащим 30 г ацетата свинца и 1 г гидрокарбоната натрия, растворённых

в100 мл дистиллированной воды.

3Ацетат свинца крайне токсичен для роста бактерий, поэтому индикаторные полоски не должны касаться культуры. Для постановки теста полоски помещают в

404

в чёрно-коричневый цвет. Следует помнить, что ферментация сахарозы может подавлять продукцию сероводорода, поэтому среда Олькеницкого является менее чувствительной к сероводороду, чем среда Клигнера.

Вопрос о возможности образования сероводорода чумным микробом долгое время оставался открытым, поскольку, если инкубировать в мясопептонном бульоне, содержащем цистеин в концентрации 0,1–1%, реакция будет положительной. Вместе с тем в настоящее время принято считать, что чумной микроб сероводород не образует.

Уреазный тест применяют для исследования способности бактерии гидролизовать мочевину до аммиака и углекислого газа, то есть продуцировать уреазу. Для проведения теста производят посев культуры в агар Кри стенсена с мочевиной или уреазный бульон Ру стигана – Стю арта и инкубируют при 28°С, учитывая результаты через 2, 4 и 24 часа. При положительной реакции вследствие сдвига рН в щелочную сторону среда окрашивается в красный цвет (при отрицательном результате цвет среды не меняется и наблюдение продолжают до четвёртого дня).

Данный тест является одним из основных, позволяющих дифференцировать Y. pestis от Y. pseudotuberculosis, поскольку чумной микроб (в отличие от псевдотуберкулёзного) не расщепляет мочевину1. Традиционно определяют уреазную активность по методу

пробирку со средой на расстоянии 2,5 см от культуры, закрепляя свободный конец полоски пробкой. Данный тест, хотя и сложен, примерно в 10 раз чувствительнее культурального.

1 У некоторых штаммов уреаза выявляется при разрушении бактериальных клеток. Кроме того, иногда она определяется у свежевыделенных штаммов в период острой эпизоотии и утрачивается при затухании, а также при хранении культур без дополнительной селекции на питательных средах. Причина этого явления, вероятно, кроется в том, что в гене ureD чумного микроба содержится вставка добавочного гуанинового остатка в поли-G-участке, что приводит к образованию стоп-кодона, который и препятствует синтезу уреазы. Однако иногда может происходить делеция (т. е. потеря в результате хромосомной перестройки) этого добавочного («лишнего») нуклеотида, что приводит к нормальной «работе» гена ureD и, как следствие, синтезу уреазы.

405

Галины Николаевны Ленской1. К 100 мл физиологического раствора добавляют 2%-ную кристаллическую мочевину и 1%-ный спиртовой раствор фенолфталеина. Раствор доводится до кипения, но не кипятится во избежание снижения интенсивности реакции, после чего разливается по 4 мл в пробирки. Достаточное количество (примерно 109 м.к./мл) двухили трёхсуточной культуры, выращенной при 28°С, вносят петлёй (наносят на стенку у самой кромки раствора и круговыми движениями аккуратно «смывают» в раствор). При положительной реакции вследствие сдвига рН в щелочную сторону раствор окрасится в малиново-розовый цвет.

Вместе с тем на практике этот метод почти не используется из-за возможности спонтанного сдвига рН и, как следствие, получения ложноположительных результатов (даже при аккуратном внесении культуры чумного микроба можно видеть, как раствор розовеет на доли секунды). Поэтому используют посевы на агар Кристенсена с мочевиной или уреазный бульон Рустигана – Стюарта, а также цветную дифференциальную среду, поскольку уже через сутки инкубации при 28°С, в случае чумного микроба, среда изменяет окраску с тёмно-зелёной на красно-оранжевую в случае «столбика» и сине-зелёную – в случае «косяка». Происходит это из-за полной или частичной ферментации содержащейся в среде глюкозы в анаэробных («столбик») и аэробных («косяк») условиях. В случае псевдотуберкулёзного микроба среда приобретёт синюю окраску за счёт расщепления мочевины.

Тест Фогес – Проскауэра, предложенный2 в 1898 году Даниэлем Фогесом3 и Бернгардом Проскауэром4, основан на выявлении ацетоина (ацетил-метилкарбинола), являющегося промежуточным продуктом расщепления глюкозы в пиовиноградную кислоту. Для проведения теста производят посев культуры в 5 мл бульона Клар-

1 1904–1983; советский (российский) врач, бактериолог. Лауреат Государственной премии СССР II степени (1952). Автор работ по изменчивости чумного микроба,

участник ликвидаций вспышек особо опасных инфекций.

2 Voges O., Proskauer B. Beitrag zur Ernährungspysiologie und zur Differentialdiagnose der

Bakterien der hämorrhagischen Septicämie. Zeitschrift für Hygiene und Infektionskrankheiten.

1898; 28:20–32; DOI: 10.1007/BF02285362.

3Daniel Wilhelm Otto Voges, 1867–1911; германский врач, бактериолог.

4Bernhard Proskauer, 1851–1915; германский химик. Автор работ по гигиене воды

идезинфекции.

406

ка и инкубируют при 28°С не менее 48 часов. Переносят 2,5 мл бульонной культуры в отдельную пробирку, последовательно добавляют 0,3 мл реагента I1 и 0,1 мл реагента II2. Осторожно встряхивают пробирку и оставляют на 10–15 минут, после чего учитывают результат: красное (оттенки розового) окрашивание – положительный результат, отсутствие окрашивания – отрицательный.

Тесты на нитрификацию и денитрификацию позволяют выявить способность бактерий преобразовывать соединения азота, а именно окислять аммиак (нитрификация) до нитратов, а также продуцировать нитратредуктазу, благодаря которой нитриты редуцируются в нитраты (и далее до азота). Для постановки теста в 1 мл бульона Хоттингера или Мартена добавляют 0,5 мл реактива Грисса3 для проверки на отсутствие нитратов (бульон не должен поменять цвет). В другие две пробирки с 1 мл данного бульона вносится суточная агаровая культура, причём в одну из них добавляют 0,1%- ный раствор KNO3. Обе пробирки инкубируются при температуре 28°С, и через трое суток в них добавляют по 0,5 мл реактива Грисса. При положительной реакции сразу появляется окрашивание от розового до малинового цвета, что свидетельствует о наличии в среде нитритов: в первой пробирке (без KNO3) за счёт окисления аммиака (нитрификация), а во второй (с KNO3) – в процессе редукции нитратов (денитрификация).

Нитрифицирующую активность проявляют лишь некоторые штаммы биоваров antiqua и orientalis. Денитрифицирующую активность проявляют все штаммы чумного микроба, за исключени-

ем биоваров medievalis и microtus (xilingolensis и qinghaiensis), ал-

тайских, гиссарских, таласских и улегейских штаммов. Связано это

1Способ приготовления: растворяют 5 г α-нафтола в 100 мл этилового спирта (раствор почти бесцветный, сохраняет стабильность год при хранении в тёмной посуде при 2–8°С).

2Способ приготовленя: к 40 г гидроксида калия добавляют 100 мл воды на холодной бане во избежание перегрева (раствор сохраняет стабильность год при хранении в стекляных бутылях, покрытых парафином или полиэтиленом, при комнатной температуре).

3Предложен в 1858 году германским химиком Иога нном Пе тером Гри ссом (1829–1888). Способ приготовления: 0,1 г α-нафтиламина растворяют в 100 мл дистиллированной воды при кипячении в течение 15 минут, после чего охлаждают. Затем добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл 1%-ной сульфаниловой кислоты. Смесь хранится в непрозрачной таре.

407

с мутацией в гене napA, в котором в 205 позиции вместо триплета GAA расположен триплет TAA, что препятствует синтезу единственной нитратредуктазы чумного микроба Nap1 . Напомним, что нитрифицирующая и денитрифицирующая активности, наряду со способностью ферментировать глицерин, положены в основу классификации Рене Девинья.

Наличие гемолитической активности (т. е. способность разрушать эритроциты) у чумного микроба долгое время являлось предметом дискуссии, поскольку было накоплено много противоречивых данных. Точка в этом вопросе была поставлена в 1963 году В. В. Ткачéнко2. Его опыты3 показали, что гемолиз вызывают далеко не все штаммы, причём при 37°С он наступает быстрее, чем при 28°С. Сам гемолизмин по своим свойствам не похож на известные гемолизины, являющиеся протеазами (α-гемолизин стафилококка) или лецитиназами (α-токсин Clostridium perfringens). Он термостабилен (сохраняет активность даже при 4°С) и по физикохимическим показателям близок к высшим жирным кислотам (липидам), которые могут высвобождаться при разрушении бактерии4.

Для постановки теста в пробирку с трёхсуточной бульонной культурой добавляют 0,1 мл дефибринированной крови и инкубируют сутки при 37°С. При положительной реакции среда обесцветится (Рис. 31.4). Следует помнить, что наиболее чувствительными к гемолизину являются эритроциты собаки. Затем, в порядке сниже-

1Следует отметить, что существуют также атипичные «полёвочьи» штаммы, у которых имеет место замена триплета GCC на триплет ACC в 341 позиции, что ведёт

кзамене гидрофобного аланина на гидрофильный треонин, ввиду чего Nap теряет свою активность.

2Советский врач, бактериолог. К сожалению, в настоящее время известны только его инициалы, дошедшие до нас в виде нескольких печатных работ и упоминаний в

научной литературе.

3Ткаченко В. В. О химической природе чумного гемолизина, Дис. … кандидата меди-

цинских наук. Ростов-на-Дону, 1964, 115 с.

4Это объясняет отсутствие связи чумного гемолизина с водорастворимыми фракциями (например, мышиным токсином) и сохранение гемолитической актив-

ности после отмывки культуры. Следует отметить, что хотя липиды Y. pseudotuberculosis также обладают гемолитической активностью, после отмывки бактерия теряет это свойство.

408

ния, идут эритроциты лошади, кролика, голубя, крысы, морской свинки и человека, лизис которых происходит не ранее 72 часов инкубации. Эритроциты барана и верблюда наиболее устойчивы, хотя чувствительность эритроцитов различных животных во многом зависит от состава питательной среды.

Вопреки всему вышесказанному, патологоанатомические исследования обнаруживают большое количество разрушенных эритроцитов внутри и вне сосудов, особенно в печени и селезёнке. Как такое возможно, если гемолитическая активность чумного микро-

ба невелика? По мнению Игоря Валериановича Домарадского, гемолиз при чуме «возникает вне зависимости от гемолитических свойств возбудителя чумы под влиянием появляющихся в больном организме эндогенных гемолитических факторов». Однако данный вопрос вплоть до настоящего времени остаётся открытым.

Результаты приведённых тестов для чумного микроба, этакое своеобразное «меню», приведены в Табл. 31.1 и 31.2.

Альтернативой их служат коммерческие системы индикаторных бумаг (СИБы), панели биохимической идентификации и системы автоматизированной идентификации. Первые представляют собой бумажные диски, пропитанные средами с индикатором, а вторые и третьи – панели с лунками, содержащими высушенные среды с индикаторами. Принцип действия схож: диски раскладывают по пробиркам и заливают суспензией исследуемой культуры, а в лунки сразу заливают суспензию культуры и всё инкубируют, после чего учитывают результаты (в последней системе учёт осуществляется компьютером). Важно понимать, что качество результата зависит от добросовестности производителя. С другой стороны, иногда результаты биохимических тестов не совпадают с информацией, представленной в книге, поскольку каждый существующий штамм индивидуален.

409