Опера о чуме (учебник)

ключается в том, что краситель2 растворяют в дистиллированной воде (1–2 капли на 1 мл воды) и наливают в чашку Петри, куда предварительно помещена подставка под предметное стекло. Затем мазок, предварительно фиксированный в метиловом спирте, помещают в чашку Петри таким образом, чтобы он соприкасался с раствором (т. е. стороной, на которую нанесён мазок, вниз) и оставляют до двух часов (но не менее получаса).

Разновидностью описанного метода является окрашивание по Рáйту, предложенное Джéймсом Гомéром Рáйтом3. Суть метода заключается в том, что на нефиксированный мазок, помещённый в чашку Петри, наносят несколько капель красителя4 и выдерживают минуту, после чего добавляют равное количество дистиллированной воды. Через 2–3 минуты мазок промывают дистиллированной водой до тех пор, пока не появится розоватый оттенок.

Окрашивание по Вéйсону, предложенное Н. Е. Вéйсоном 5 , также позволяет увидеть биполярное окрашивание клеток чумного микроба. Сообщается6, что метод наиболее чувствителен в случае чумного менингита. Суть метода заключается в том, что на мазок, предварительно нагретый и остуженный (помним: данный этап не является обеззараживанием!), помещённый в чашку Петри, наносят несколько капель красителя7 и выдерживают 10–20 секунд, после чего заливают дистиллированной водой и высушивают.

1Gustav Giemsa, 1867–1948; немецкий химик, фармацевт, бактериолог. Автор работ по тропической медицине.

2Способ приготовления: состав, состоящий из 3,772 г хлорида диметилтионина (азур В, азур II), 2,165 г эозина и 1,563 г метиленового синего, растворяют в 750 мл метанола и 256 мл глицерина.

3James Homer Wright, 1869–1928; американский врач, патологоанатом.

4Способ приготовления: 1%-ный раствор метиленового синего на 0,5%-ном водном растворе гидрокарбоната натрия нагревают до 100°С и кипятят в течение часа, после чего охлаждают и фильтруют. Затем к 100 мл фильтрата, имеющего пурпурный оттенок, добавляют 500 мл 0,1%-ного водного раствора эозина. Выпавший осадок фильтруют, высушивают и растворяют в метиловом спирте (0,1 г красителя на 60 мл спирта).

5N. E. Wayson; американский врач, бактериолог.

6Meyer K. F., Batchelder A. P. A disease in wild rats caused by Pasteurella muricida. J Infect Dis. 1926; 39:386–412.

7Способ приготовления: раствор, состоящий из 0,2 г основного фуксина, 0,75 г метиленового синего и 20 мл 95%-ного раствора этилового спирта, медленно влива-

390

Для обнаружения капсулы используют следующие способы окраски.

Способ, предложенный Ольтом:

1.на мазок наносят свежеприготовленный 3%-ный водный раствор сафранина и подогревают над пламенем горелки;

2.через 3–6 минут с момента появления паров промывают дистиллированной водой и просушивают.

Микроорганизмы и фон мазка окрашиваются в яркооранжевый, а фон – в бледно-жёлтый. Если после окраски окраски сафранином на мазок нанести 1%-ный водный раствор метиленового синего (в течение 2 минут), то микроорганизмы окрасятся в синий цвет, а капсулы – в розовый.

Способ, предложенный Клéттем:

1.на только что обожжённый для удаления остатков фиксирующего раствора мазок (ещё тёплый) наносят свежеприготовленный кипящий раствор спиртовой синьки и подогревают;

2.через две минуты тщательно промывают дистиллированной водой;

3.наносят фуксин и через 30 секунд снова промывают дистиллированной водой, после чего просушивают.

Микроорганизмы окрашиваются в тёмно-синий цвет, а капсула – в розовый.

Способ, предложенный Ги нсом:

1.на обезжиренное предметное стекло наносят капельку жидкой туши, вносят в неё петлёй культуру и растирают круговыми движениями (не размазывая каплю);

2.шлифованным стеклом делают мазок и фиксируют его;

3.на только что обожжённый для удаления остатков фиксирующего раствора мазок (ещё тёплый) наносят на 30 минут

ют в 200 мл 5%-ного раствора фенола, после чего фильтруют и хранят в непрозрачной таре.

391

метиленовую синьку Лёффлера 1 или на 5 минут фуксин Циля2;

4. промывают дистиллированной водой и просушивают.

Микроорганизмы окрашиваются в синий (в случае синьки) или красный (в случае фуксина) цвет, а капсула будет бесцветной на тёмном фоне. При окрашивании данным способом следует сделать контрольный мазок из туши без бактерий, чтобы убедиться в отсутствии контаминации. Следует отметить, что некоторые специалисты окрашивают без обжигания после фиксации, чтобы не повредить капсулы.

Для изучения подвижности микроорганизмов готовят препараты висячей и раздавленной капли, что требует особенной осторожности. На поддон с салфеткой, смоченной раствором дезинфектанта, помещают чашку Петри, в которую кладут предметное стекло. Наносят на него с помощью петли агаровую культуру (как было описано выше) или одну каплю бульонной культуры. Рекомендуется использовать молодые культуры, только что взятые из термостата, поскольку по мере охлаждения культуры подвижность бактерий будет падать, а затем и вовсе прекратится. После нанесения культуры на предметное стекло берут покровное стекло (стекло с луночкой для висячей капли) и, предварительно нанеся на его края вазелин для лучшей фиксации, располагают его на предметном таким образом, чтобы его углы выступали за край (т. е. кладут ромбиком), что значительно облегчит его снятие. Подвижность изучают микроскопированием препарата, при этом бактерии, обладающие пассивной активностью, будут колебаться на одном месте, тогда как бактерии, обладающие активной подвижностью, перемещаются по полю препарата.

В качестве альтернативного (и более безопасного) метода используют посев культуры в столбик 0,3%-ного полужидкого агара Хоттингера или Мартена. Поскольку чумной микроб неподвижен,

1Предложена Лёффлером. Способ приготовления: в 100 мл дистиллированной воды с 1 мл 1%-ного раствора гидроксида калия добавляют 30 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора метиленового синего.

2Предложен немецким врачом Францем Цилем (1857–1926). Приготавливается как фуксин Пфейффера без последней стадии разведения дистиллированной водой

всоотношении 1:10.

392

Рис. 30.17.

Рост изолированных колоний смеси Y. pseudotuberculosis

(крупные колонии) и Y. pestis (мелкие колонии) в слое 0,35%-ного LB-агара, в который добавлен 1%-ный раствор ТТХ для окраски колонии (любезно предоставлено Татьяной Евгеньевной Арсеньевой)

Ещё один интересный способ, предложенный в середине прошлого века, заключается в добавлении в агар Хоттингера малахитового зелёного в концентрации 1:12000, что приводит к значительному подавлению роста Y. pseudotuberculosis при посеве 0,1 мл исследуемой культуры (105 м. к./мл). Колонии Y. pestis вырастают окрашенные в зелёный цвет, а на 5–7 сутки среда обесцвечивается.

После изучения препаратов и мазков, и их последующей окраски (Рис. 13.8, 30.18, 30.19) можно видеть, что

Y. pestis представляет собой грамотрицательную мелкую (1–3 х 0,5–0,7 мкм) неподвижную палочку прямой или овоидной, бочкообразной формы, для которой характерен полиморфизм: наряду с обычными коккобациллами и палочками встречаются более длинные палочки.

Окрашивается биполярно (по типу «английской булавки»).

Ранее мы говорили, что противочумные сыворотки больше не используются в клинической практике, но они нашли широкое применение в лабораторной диагностике. Одним из примеров та-

кого применения является метод флуоресцирующих антител (МФА;

РИФ, реакция флюоресценции), в котором антитела конъюгированы (т. е. соединены) с органическими флюорохромами – красителями, вызывающими флуоресценцию объекта при облучении коротковолновыми лучами (люминесцентной микроскопии).

394

Различают прямой и непрямой

метод, разработанный Альбертом Ку нсом1 (прямой совместно с Мéлвином Каплáном2, непрямой совместно с Тóмасом Уэ ллером3). В первом случае на исследуемый объект наносят флуоресцирующее антитело, в результате чего организуется связь «антиген – антитело». Данный метод счита-

ется наиболее чувствительным и специфичным, однако он позволяет обнаружить только один вид микроорганизма. Во втором случае на исследуемый объект наносят первое антитело (в результате чего организуется связь «антиген – антитело»), а затем второе антитело, являющееся флуоресцирующим и видоспецифичным против первого антитела (т. е. организуется связь «антиген – антитело – (ф) антитело»). Достоинством данного метода является возможность обнаружения различных микроорганизмов, а также антител.

Для обнаружения чумного микроба применяют прямой МФА, в котором используются флуоресцирующие антитела

Рис. 30.19. Мазок мокроты от больного первичной лёгочной чумой, окрашенный по Лёффлеру (эпидемия чумы в городе Бомбей в 1897 году).

Можно видеть биполярно окрашенные клетки чумного микроба, некоторые из которых расположены цепочками

(по Albrecht H., 1898)

1 Albert Hewett Coons, 1912–1978; американский врач, иммунолог, бактериолог,

патологоанатом.

2 Coons A. H., Kaplan M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 1950; 91(1):1–13; DOI: 10.1084/jem.91.1.1.

3 Weller T. H., Coons A. H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella and herpes zoster propagated in vitro. Proc Soc Exp Biol Med. 1954; 86(4):789–794; DOI: 10.3181/00379727- 86-21235.

395

цирующее иммерсионное масло (допускается применение забуференного глицерина) и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. Специфическим для чумного микроба считают изумрудно-зелёное свечение клеток, при котором флуоресцирующая периферическая часть микробной клетки («ободок») чётко ограничена от центральной её части (Рис. 30.20).

Оценку результатов проводят по так называемой системе четырёх крестов:

…По каменистому берегу Симоодамáти гуляет человек. Мелкие волны, накатываясь одна на другую, играют золотом в косых лучах вечернего солнца, словно струны кóто1. Вокруг так тихо, что можно слышать собственные мысли. Эту картину умиротворения прерывает лишь еле виднеющееся свечение – это живущий в море ёкай Амáбиэ2 своим зелёным светом пытается прогнать чуму, сигнализируя, как и люм-сыворотка, о её появлении…

1Традиционный японский щипковый музыкальный инструмент, представляющий собой длинную цитру. До XX века был солирующим инструментом.

2Яп. ; ёкай в виде русалки с длинными волосами и тремя ногами. Согласно легенде в мае 1846 года у побережья Восточно-китайского моря провинции Хиго (ныне – префектура Кумамо то, Япония) стали появляться странные огни. Когда один из чиновников прибыл расследовать происходящее, к нему из воды вышел ёкай, поведавший своё имя и предрёкший хороший урожай в течение нескольких будущих лет. Кроме того, он уточнил, что если возникнет эпидемия, следует показывать его изображение заболевшим для исцеления. История и изображение были опубликованы в газете, став очень популярными (такие одностраничные газеты

397

Газета с изображением Амабиэ и рассказом о его появлении

(любезно предоставлено Главной библиотекой Киотского университета)

часто вешали на деревья). В XX веке изображение было запрещено, поскольку мешало проведению санитарных мероприятий (люди не хотели соблюдать предписания санитарных врачей, защищаясь изображениями), однако в XXI веке, во время пандемии COVID-19, оно было использовано Министерством здравоохранения Японии в качестве символа борьбы с пандемией.

398

Как и все бактерии семейства Enterobacteriaceae, чумной микроб является оксидазо-отрицательным и каталазо-положительным, то есть в первом случае он не синтезирует цитохромоксидазу или индофенолоксидазу, которые катализируют перенос электронов от доноров водорода к акцепторам, а во втором – синтезирует каталазу, которая гидролизует перекись водорода с образованием воды и кислорода. Для исследования оксидазной активности используют 1%-ный раствор тетраметил-р-фенилендиамин дигидрохлорида (50 мг реагента на 5 мл дистиллированной воды; используют в течение суток!), который наносят на чашку с культурой в виде капли или пропитанной бумажки. При положительном результате бесцветный раствор окрашивается в тёмно-фиолетовый1, но, как можно догадаться, в случае чумного микроба окрашивания не происходит. Для исследования каталазной активности используют 3%-ный раствор перекиси водорода, который наносят на свежеприготовленный (нефиксированный) мазок культуры. При положительном результате можно наблюдать появление пузырьков.

Поскольку набор ферментов, катализирующих все жизненно необходимые реакции, протекающие в бактериях, индивидуален для каждого вида (можно сказать, что это своего рода «вкусовые предпочтения» бактерии), исследование ферментативной активности каждого конкретного штамма позволяет определить его видовую принадлежность, а для некоторых бактерий, и чума тут не исключение, дифференцировать внутри вида (Табл. 31.1 и 31.2). Конечно, синтез ферментов кодируется генами и узнать о «вкусовых предпочтениях» мы могли бы легко с помощью современных моле- кулярно-генетических методов, в частности секвенирования, однако эти методы способны только определить наличие гена, но не ответить на вопрос, работает он или нет. Поэтому подобные бактериологические исследования, существующие уже несколько веков и

1 Следует учитывать, что коммерческие тест-полоски часто дают ложноотрицательный результат.

399