121212. Принципы культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов в лабораторных условиях.

Поскольку микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному кислороду, это определяет и различия в способах их культивирования.

Культивирование аэробных микроорганизмов:

1) На поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха;

2) В жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование.

Культивирование анаэробных микроорганизмов: выделяют физические, химические и биологические методы культивирования анаэробных микроорганизмов.

1) К физическим методам создания анаэробных условий относится культивирование в микроанаэростате – вакуумном аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью (чаще всего используют смесь, которая содержит азот с 5% углекислого газа и 10% водорода);

2)  К химическим методам относится использование химических веществ, поглощающих молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na₂S₂O₄), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы;

3) Биологический метод заключается в комбинированном посеве культур анаэробов и аэробов. Посев производят на чашку с толстым слоем кровяного агара с глюкозой, разделенную пополам небольшой дорожкой, вырезанной посередине чашки прокаленным скальпелем. На одной половине чашки делают посев культуры аэробов, а на другой – анаэробов. Края чашки смазывают парафином для герметизации и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробов, когда они исчерпывают из чашки кислород, начинается рост анаэробов.

Кроме того, для культивирования анаэробов можно использовать следующие приемы: посев уколом в высокий столбик сахарного агара, который сверху заливается слоем вазелинового масла; посев на среду Китта-Тароцци (МПБ, глюкоза, кусочки печени или мяса в качестве редуцирующих веществ, сверху среда залита слоем вазелинового масла), эта среда предназначена для культивирования анаэробных микроорганизмов.

131313. Биохимическая активность микроорганизмов, ее определение и дифференциально-диагностическое значение.

Биохимическая активность микроорганизмов связана с работой ферментов, которые катализируют различные химические реакции.

Ферменты – биологические катализаторы. Они имеют белковую природу, сравнительно высокий молекулярный вес, высокоспецифичны, быстро действуют, термолабильны, способны сохранять свою активность и после гибели клеток.

Выделяют экзоферменты, катализирующие процессы расщепления сложных веществ вне клетки, и эндоферменты, которые катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки.

Кроме того, выделяют несколько основных классов ферментов:

1) Оксидоредуктазы – окислительно-восстановительные ферменты (к ним относят дегидрогеназы, оксидазы);

2) Трансферазы – переносят отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим;

3) Гидролазы – ускоряют реакции гидролиза, т.е. расщепление веществ на более простые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы);

4) Лиазы – разрывают связи между атомами углерода негидролитическим путем (карбоксилазы);

5) Изомеразы – превращают органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза);

6) Лигазы – ускоряют синтез сложных соединений из более простых веществ (аспарагин-синтетаза).

Кроме этого различают: конститутивные ферменты, которые синтезируются клеткой постоянно (лиазы, оксидазы); индуктивно-адаптивные – синтезируются только в присутствии субстрата (пенициллиназа, щелочная фосфатаза).

У патогенных микробов есть еще и ферменты агрессии, которые способствуют проникновению, распространению и паразитированию микроорганизмов в макроорганизме (гиалуронидаза, коллагеназа, нейраминидаза, коагулаза, ДНКаза).

Значение ферментов: катализируют процессы дыхания, питания, размножения, в диагностике при определении вида возбудителя по биохимическим свойствам. С этой целью применяют среды «пестрого ряда», на которых изучают способность ферментов микробов разлагать углеводы, белки до конечных продуктов обмена. Каждый вид микроба обладает определенным набором ферментов, что обусловлено генотипом. Наибольшая активность у непатогенных микробов. У патогенных микробов биохимическая активность ниже. Ферменты микробов используют в генной инженерии для получения биологически активных соединений, для получения уксусной, молочной, лимонной и других кислот, молочнокислых продуктов, в виноделии и других отраслях. Их добавляют в качестве биодобавок в стиральные порошки для уничтожения загрязнений белковой природы.

Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы (сахаролитические свойства) используют короткий и длинный «пестрый ряд». К первому относятся жидкие питательные среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом – маннитом. В длинный «пестрый ряд» наряду с этими углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза), полисахариды (инулин, крахмал) и спиртами (глицерин, инозит). В качестве индикатора ко всем средам добавляют реактив Андреде. Чистую культуру засевают петлей в среды «пестрого ряда». Инкубируют при температуре 37 градусов в течение 18-24ч. Если бактерии ферментируют углеводы до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении до кислоты и газа, помимо изменения цвета, появляются пузырьки. Если используются среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав среды Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, отсюда и название.

Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры бактерий уколом в столбик 10-20% желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при температуре 20-22 градусов в течение нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образую фигуру, напоминающую воронку или елочку.

Метод определения аммиака заключается в укреплении над пробиркой лакмусовой бумажки так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой, посинение бумажки свидетельствует об образовании аммиака.

Реакция на индол. Применяют способ Эрлиха, который заключается в добавлении в пробирку с культурой бактерий 2-3 мл эфира, после чего содержимое перемешивают и добавляют к нему несколько капель реактива Эрлиха. В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание, вскоре приводящее к появлению розового кольца. Реактив Эрлиха содержит пара-диметил-амино-бензальдегид и хлороводородную кислоту.

Реакция на сероводород. Делают посев культуры бактериальным уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления сероводорода (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфат натрия). При наличии сероводорода происходи почернение агара.

Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят каплю 1-2% раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает перекись на кислород и воду. Выделение пузырьков кислорода свидетельствует о наличии каталазы.