Серологические методы

HLA-специфичности могут быть выявлены с помощью типирующих сывороток, полученных из крови многократно рожавших женщин. Метод называется «серологическое HLA-типирование», выполняется в микролимфоцитотоксическом тесте с последующим микроскопированием. С разработкой и внедрением новых биотехнологий, а именно получения моноклональных сывороток, были выявлены как новые HLA-специфичности, так и аллели уже известных генов.

Генные

Существуют специфичности, которые не выявляются с помощью сывороток. Они были обнаружены при использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принципиальное отличие данного метода в том, что выявляются непосредственно гены системы HLA. Метод значительно более чувствительный по сравнению с серологическим, т.к. сыворотки, содержащие антитела, зачастую дают ложноположительные реакции, поскольку могут содержать и другие антитела, а процесс получения моносывороток сложен и трудоемок. Данный метод позволяет открывать не только новые гены HLA, но и аллели уже известных генов.

Аллелям, выявляемым при помощи ПЦР, присваиваются четырех- и пятизначные номера. Типирование до этих аллелей называется типированием высокого разрешения (high resolution) и применяется при пересадке костного мозга.

При HLA-типировании реципиентов, нуждающихся в трансплантации аллогенной почки, и потенциальных доноров используются наборы низкого разрешения (low resolution) – этого достаточно для трансплантации почки, печени, сердца и др.

Полиморфизм генов HLA является главной причиной развития иммунной реакции и отторжения при пересадке солидных органов и гемопоэтических клеток костного мозга. Подбор максимально генетически совместимого донора был и остается основой для успешного приживления трансплантата и длительности его функции, несмотря на определенные успехи в области иммуносупрессивной терапии, хирургии и криоконсервации донорских органов.

В HLA-номенклатуре в пределах каждого локуса (А, В, DR) различают три уровня генетического полиморфизма: базовый (broad), расщепленный (split) и аллельный (allelic) (смотри рис 3).

Базовый уровень получил название серологического, поскольку первоначально полиморфизм HLA изучался при помощи лимфоцитотоксического теста или серологического типирования лейкоцитов. Позднее при анализе ДНК было обнаружено, что в пределах одной серологической группы существует широкая генетическая вариабельность.

Полиморфные участки ДНК в пределах одной группы называют аллелями. Таблицы HLA-антигенов ежегодно обновляются, поскольку открываются новые аллельные варианты генов. Хотя генетические различия в пределах одного аллеля не ограничиваются четырехзначными цифрами, дальнейшее расщепление гена не приводит к значимой иммунной атаке со стороны иммунокомпетентных клеток. Поэтому даже при трансплантации костного мозга обычно достаточно генотипирования с точностью до четвертого знака (или аллельного уровня).

В случае же трансплантации солидных органов надежная удовлетворительная приживаемость трансплантата достигается при подборе совместимого донора по пяти основным локусам – A, B, Cw, DR, DQ – на уровне серологической группы.

Всего на данный момент известно около 8,5 тыс. аллелей, 6725 из которых относятся к HLA I класса, а 1771 – II класса.

Практические аспекты типирования НLА антигенов

Типирование НLА антигенов требуются в ходе стандартных медицинских процедур обследования во время начала беременности, или для изучения этологии аутоимунных заболеваний. Еще более важно определение гистосовеместимости в транплантологии, где типирование HLA-фенотипа донора является обязательным условием.

Представьте себе такую ситуацию: необходимо определить принадлежность пятна крови. Чья эта кровь – человека или животного? Нет необходимости объяснять, что такая ситуация чаще всего имеет отношение к криминалистике. И решение задачи зачастую становится ответом на главнейшие вопросы следствия. Ответить не него можно только с помощью иммунных сывороток. Ни по каким другим показателям различить кровь человека и, например, собаки невозможно. Микроскопические или биохимические методы исследования бессильны.

Высокий полиморфизм делает систему HLA великолепным маркером в популяционно-генетических исследованиях и изучении генетической предрасположенности к заболеваниям, но в то же время создает проблемы в подборе пар донор –реципиент при трансплантации органов и тканей.

Типирование HLA-антигенов широко используется в судебно-медицинской практике для исключения или установления отцовства, родства.

С помощью молекулярно-генетических методик ежегодно открываются новые аллели генов HLA и их выявление продолжается несколько десятков лет. Дальнейшее развитие тканевого ДНК-типирования может способствовать более точному подбору пары «донор – реципиент», что позволит улучшить результаты трансплантации органов.

Для определения совместимости пациента и донора кроветворных клеток по системе HLA используется дорогостоящий молекулярно-генетический метод, как наиболее точный и надежный, позволяющий исключить какие-либо лабораторные ошибки и обеспечить наибольшую совместимость.

НLА в популяциях

Популяционные исследования, проведенные во многих странах мира, выявили характерные различия в распределении HLA- антигенов в разных популяциях.

Изучение различия HLA-антигенов используются в генетических исследованиях для изучения структуры, происхождения и эволюции различных популяций. Например, грузинская популяция, относящаяся к южным европеоидам, имеет сходные черты HLA-генетического профиля с греческой, болгарской, испанской популяциями, указывающими на общность их происхождения.

Распределение HLA-антигенов оказалось разным у представителей разных рас и национальностей. С 1966 г. интенсивное исследование структуры антигенов тканевой совместимости по инициативе ВОЗ стало проводиться во всех странах мира. Вскоре карта мира оказалась покрытой иммунологическими иероглифами, показывающими, где и в каком сочетании встречаются антигены HLA.

Теперь, пожалуй, нет необходимости подобно Туру Хейердалу снаряжать экспедицию на тростниковой лодке, чтобы доказать миграцию населения из Южной Америки на острова Полинезии.

Достаточно взглянуть в современный атлас распространения HLA- антигенов и с уверенностью сказать, что в обоих этих географических регионах есть общие генетические маркеры.

НLА и заболевания человека, механизмы ассоциации.

Наиболее информативными методами, позволяющими установить связь между антигенами системы гистосовместимости (HLA) и различными заболеваниями, являются популяционный и семейный анализ. Популяционный анализ обычно проводят путём типирования групп здоровых лиц и больных с чётко установленной нозологической формой и последующего сравнения генных частот или частот антигенов. Семейный анализ даёт возможность выявить или опровергнуть наследственную предрасположенность к тому или иному заболеванию, показать связь генов HLA друг с другом или другими генами.

Связь HLA с заболеваниями базируется как на генетической детерминированности (сцепленности), так и генетической ассоциации.

В первом случае «патологический» ген имеет истинное сцепление с HLA комплексом, то есть локализуется в той же хромосоме.

Однако чаще всего связь HLA и заболеваний проявляется в форме ассоциаций, которые имеют различную степень проявления. В этих случаях можно говорить лишь о предрасположенности к патологии. Причём один и тот же ген может иметь сильную связь с одним заболеванием и слабую связь с другим. В настоящее время установлена большая группа болезней, в определённой степени ассоциированных с отдельными антигенами и гаплотипами (набором антигенов). При этом генетически детерминированные различия в силе иммунного ответа, которые определяют начало течения и исход заболевания, регистрируются в течение всей жизни и наиболее ярко проявляются в критические периоды онтогенеза, формируя так называемые «группы риска». К числу таковых можно отнести и людей пожилого и старческого возраста.